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牛呼吸疾病综合征七病原联合检测多重qPCR方法的建立  PDF

  • 徐恩红 1,2,3 ✉
  • 祁明普 1,2,3
  • 项志杰 1,2,3
  • 胡长敏 2
  • 陈颖钰 1,2,3
  • 陈建国 2
  • 陈曦 2
  • 郭爱珍 1,2,3,4 ✉
1. 华中农业大学动物医学院，武汉 430070； 2. 农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室，武汉 430070； 3. 湖北洪山实验室，武汉 430070； 4. 湖北省兽医流行病学国际科技合作基地/农业农村部兽用诊断制剂创制重点实验室/ 农业农村部反刍动物生物制品重点实验室，武汉 430070

中图分类号： S852.61

最近更新：2023-03-31

DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2023.02.006

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EN 引
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摘要

为了提高牛呼吸疾病综合征多病原混合感染的临床诊断效率，以牛支原体（Mycoplasma bovis，M.b）oppD/F基因、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P.m）ompH基因、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，M.h）gcp基因、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）gB基因、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）以及牛副流感病毒（bovine parainfluenza virus type，BPIV） 3型a和c基因型（BPIV-3a，-3c）的N基因等为检测靶标，分别设计特异性引物和Taqman探针，通过优化反应条件，采用3管7联的组合方式建立了7种病原体的多联实时荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法仅对本试验的7种病原有特异性反应，与其他常见病原无交叉反应。对M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c质粒标准品的最低检测限分别为102、102、101、102、102、102和101 拷贝/μL。组内变异系数小于2.5%，组间变异系数小于5.5%。平行应用该方法和常规PCR方法对临床采集的115份有呼吸道症状牛的鼻拭子进行检测，P.m阳性率36.65%，M.b阳性率27.83%，M.h阳性率25.22%，IBRV阳性率11.30%，BPIV-3c阳性率8.57%，BRSV阳性率0.95%；其中混合感染率为26.1%。共检测到11种混合感染模式，主要由M.b与其他病原体的混合感染，占72.7%（8/11）；M.b/P.m混合感染的检出率最高，占60%（18/30）；M.b、P.m、M.h在混合感染中出现率排前三，其占比分别为73.3%（22/30）、73.3%（22/30）和43.3%（13/30）；其次为IBRV，占26.7%（8/30）； BPIV-3c 占13.3%（4/30）。以上结果表明，该方法具有较高的分析敏感性和特异性，可用于牛呼吸疾病综合征多病原感染的联合检测。

牛呼吸疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRDC或BRD）是由牛支原体等多种病原体联合作用、环境应激因素诱导下所发生的、以牛支气管肺炎为主要症状的一种牛常见传染病的总称。BRD在世界各地广泛流行，各品种和年龄阶段的牛均可发生，随着现代牛业集约化和专门化模式的发展而呈上升趋势，如长途运输、转群、气侯变化、分娩等环境应激因素是该病常见的诱发因素［

1］。BRD可四季发生，典型症状主要为发热、精神沉郁、呼吸困难、咳喘、眼分泌物增多、流涎等，急性型病例甚至出现忽然倒地，口鼻流出泡沫状液体并快速死亡［2］。BRD发生后可造成永久性肺损伤，使患牛生长缓慢，更容易受到随后的环境应激因素而复发，从而降低养殖场的经济效益［3］。

有数据显示，在美国的肉牛养殖场中，70%~80%的牛发病与BRD有关，同时BRD致死牛占总数的40%~50%，导致美国每年损失超过5亿美元［

4］。在日本，农林部2014年报告的统计数字表明，呼吸系统疾病占牛病的23%［5］。BRD也给我国养牛业带来重大损失，主要发生在初生犊牛、断奶转群牛和经历长途运输的新引进牛，但具体损失无准确数据。因为病因复杂，诊断、治疗和预防该病的措施有限，该病尚未得到有效控制［6］。鉴于早期、快速和准确的诊断是有效控制该病的前提，且目前已报道的检测方法存在检测病原数量少和操作复杂等问题［7-10］，本研究针对BRD最常见的7种病原体包括牛支原体（Mycoplasma bovis，M.b）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P.m）、牛溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，M.h）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、牛副流感病毒3型a基因型（bovine parainfluenza virus type 3a，BPIV-3a）和c基因型（BPIV-3c），建立一种能够同时检测以上7种病原的荧光定量PCR检测方法，以期为临床诊断BRD提供一种敏感、特异、多联、快速的病原学检测方法，为早期确诊BRD，实施精准治疗和防控方案、提高养殖效益，以及有效开展BRD病原学和流行病学监测研究等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病原体、质粒及临床样品

1）病原体。牛支原体、多杀性巴氏杆菌（A型、B型、D型、F型）、牛溶血性曼氏杆菌（A1型和A6型）、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3a基因型、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、沙门氏菌、摩氏摩根菌、大肠杆菌、昏睡嗜组织杆菌（旧称为昏睡嗜血杆菌）、不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、无乳支原体、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、乳房链球菌、停乳支原体、猪伪狂犬病毒等病原体均由笔者所在实验室分离保存，使用前均经PCR和测序鉴定正确。

2）牛溶血性曼氏杆菌重组质粒。参照文献［

11］制作重组质粒，其步骤简述如下：以牛溶血性曼氏杆菌阳性核酸为模板，进行目的基因PCR扩增及产物纯化回收，回收产物与pMD19-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞培养，通过蓝白斑筛选，挑取单克隆白色菌落进行PCR鉴定，检测阳性的菌落送北京擎科生物公司测序。通过序列比对，测序结果与克隆基因目的片段完全一致的阳性克隆接种至Amp*LB液体培养基，提取质粒。根据计算公式：质粒拷贝数=［6.02×1023×质粒质量浓度（ng/μL）×10-9］/（质粒碱基数×660），进行质粒拷贝数浓度换算，-20 ℃保存备用，作为荧光定量PCR的标准品。

牛支原体、多杀性巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3a和3c基因型的重组质粒均由北京擎科生物技术有限公司构建合成并完成鉴定（表1）。

表1  BRD 7种病原重组质粒信息
Table 1  Recombinant plasmids of seven BRD pathogens
病原Pathogens基因登录号Accession number靶基因Target genes载体Vectors

插入片段大小(bp)及在靶基因中位置(nt)

Insert fragment size and position

M.b CP042939.1 OPPD\F pMD18T 191（66~256）
P.m CP033600.1 ompH pMD18T 183（329~511）
M.h CP017484.1 GCP pMD18T 171（247~417）
IBRV MG407785.1 gB pMD18T 118（1 486~1 603）
BRSV AF054664.1 N pMD18T 149（585~733）
BPIV-3a MH552577.1 N pMD18T 153（1 322~1 474）
BPIV-3c LC040886.1 N pUC57 1548（1~1 548）

3）临床样品。115份牛鼻拭子均采集自2021-2022年间，华中地区不同牛场发生牛呼吸道疾病的病牛。经常规PCR检测，58份样品为病原阳性。

1.2 主要试剂

核酸染料Gel-red、50 bp DNA Ladder、DL 2000 DNA Marker、2×Taq Master Mix、2×T5 Fast qPCR Mix（Probe）为北京擎科生物技术有限公司产品；PrimeSTAR Max DNA Polymerase 为宝日医生物技术（北京）有限公司（TaKaRa中国）产品；HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR反转录试剂盒、Virus DNA/RNA Extraction Kit 2.0（Prepackaged）核酸提取试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品，质粒小提试剂盒为OMEGA公司产品，凝胶回收试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品。琼脂粉、氨苄青霉素为Ameresco公司产品；NaCl为国药集团化学试剂有限公司产品。

1.3 引物探针设计与合成

从GenBank中批量下载M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV和 BPIV-3的基因组序列，用MEGA7进行序列比对，挑选序列多样性低的区域，作为目的扩增区域。此外，根据核酸相似性，挑选能代表该病原多数基因的序列作为参考序列。经序列比对，发现BPIV-3不同基因型间的核酸相似性低，无法满足引物和探针的设计，因此挑选在中国流行较多的BPIV-3a和 BPIV-3c的基因序列，分别进行序列比对及引物和探针的设计。最终，以M.b（CP042939）、P.m（CP033600）、M.h（CP017484）、IBRV（MG407785）、BRSV（AF054664）、BPIV-3a（MH552577）和BPIV-3c（LC040886）作为参考序列，设计7种病原的特异性引物及相应的TaqMan探针（表2），用于扩增M.b的oppD/F基因，M.h 的GCP基因，P.m的ompH基因，IBRV的gB基因，BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c的N基因。引物探针均由北京擎科生物技术有限公司合成。

表2  用于BRD 7种病原qPCR扩增的引物探针
Table 2  Primers and probes of each BRD pathogen for qPCR amplification
引物名称 Primer names

序列5'→3'

Sequences 5'→3'

产物大小/bp

Product size

M.b-F TCGCATAACATTAGTGTTGTCG 145
M.b-R TCTGGTGGGGTTCCTTGA
M.b-P FAM-CTCATCATCATTTTCAGGTATAGCCGAGAT-BHQ1
P.m-F GCGAGCAAGAAGCGATCA 183
P.m-R CGACTGCACCTTCATTCAGTAC
P.m-P Texas Red-TACCGCGTTTTGAATGCTATCCACT-BHQ2

M.h-F

M.h-R

TTGCTCTAACGCTCGCTTG 171
GGACTGGATTTCAGTTTCTCC
M.h-P HEX-CCAACAAGCCGTGGTTGATACTATTTT-BHQ1
IBRV-F AGCACCTTTGTGGACCTAA 118
IBRV-R GCTGTATCTCGCTGTAGTCG
IBRV-P CY5-CCGCGAGTTCTTGCCGCTAGAAGTGT-BHQ2
BRSV-F ACGATACAAAGGACTTATCCCA 149
BRSV-R CTGCAAAGATTCCTTCTACCC
BRSV-P CY5.5-ATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAAC-BHQ2
BPIV-3a-F CATCCATAGTTCCTTATGCATG 153
BPIV-3a-R TTGGGTCGCTCTGTTTCC
BPIV-3a-P Texas Red-CGTTGAGTCTTTTGTTCAGCCTGTCTCT-BHQ2
BPIV-3c-F ACAGTATGTAACAGGACGGTCC 126
BPIV-3c-R GCCTCTTGTGTAATCCCCAA
BPIV-3c-P HEX-TGCCACTGCTTGACCTAGTTGGAAC-BHQ1

1.4 反应条件的优化及标准曲线的建立

本研究所涉及的7种病原均以106 copies/μL质粒DNA为模板，采用控制变量法，对引物浓度1~4.5 pmol/μL，探针浓度0.5~4.0 pmol/μL，退火温度57~64 ℃，各分为8个梯度进行优化，以Ct值大小、荧光信号高低和扩增曲线变化为依据，确定最佳的反应条件。

1.5 特异性试验

提取牛常见病原体包括昏睡嗜组织杆菌、摩氏摩根菌、停乳链球菌、无乳支原体、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、伪狂犬病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3a型、牛副流感病毒3c型、牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒DNA或cDNA，并以此为模板，双蒸水为阴性对照，采用优化后的最佳反应体系条件，进行多联qPCR体系检测方法的特异性分析，本研究所涉及的7种特定病原的核酸用作阳性对照。

1.6 敏感性试验

将本研究所涉及的7种病原的质粒DNA进行10倍系列稀释，以不同浓度的质粒DNA为模板，分别将7种病原质粒DNA加入对应多重体系中，按照优化后的最佳反应体系条件，在相同条件下进行qPCR扩增，双蒸水为阴性对照进行质粒的敏感性分析。

1.7 重复性试验

将7种病原的靶基因质粒DNA进行10倍系列稀释，以不同浓度的质粒DNA为模板，进行3次批内和批间试验，用所得Ct值计算出平均Ct值、标准差和变异系数，分析多联qPCR方法的重复性。

1.8 临床样品检测

将实验室保存的临床病牛的鼻拭子反复冻融3次，随后结合EasyPure Viral DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒和VAMNE Magnetic Pathogen DNA Kit （Prepackaged）细菌核酸提取试剂盒说明书步骤，把样本放置于核酸自动提取仪中提取。提取的病毒基因组核酸按照HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR反转录试剂盒对病毒RNA反转录。采用所建立的多联荧光定量PCR方法及常规PCR方法对样品进行平行检测，比较二者符合率。常规PCR引物由北京擎科生物技术有限公司合成（表3）。采用25 μL的反应体系：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板为1 μL，ddH2O补足25 μL。扩增程序为：94 ℃预变性，35次循环（94 ℃变性，55 ℃退火，72 ℃延伸）以及72 ℃延伸，每种病原体的扩增参数略有不同（表4）。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

表3  用于BRD 7种病原体常规PCR扩增的引物
Table 3  Primers for conventional PCR amplification of 7 pathogens causing BRD

引物名称

Primer names

序列5'→3'

Sequences 5'→3'

产物大小/bp

Productsize

参考文献

References

M.b-F TAATTTAGAAGCTTTAAATGAGCGC 238 [12]
M.b-R CATATCTAGGTCAAGGCTTTG
P.m-F ATCCGCTATTTA CCCAGTGG 460 [13]
P.m-R GCTGTA AACGAACTCGCCAC
M.h-F TGTTGGTTCTGGTACGACGG 760 [14]
M.h-R GATCCGCTCGCCATTTTGAC
IBRV-F ACGGGCTGGGAAAGACAACAACGG 868 [15]
IBRV-R GCGGACACGTCCAGCACGAACA
BPIV-3-F CGGCGGTCGAGCGGCAAGAG 398 [16]
BPIV-3-R AGGCGGGAACACAGCTGGGACAAT
BRSV-F CAAACTAAATGACACTTTCAACAAG 566 [17]
BRSV-R CATTTCATTCCTTAGTACATTGTTG
表4  用于BRD 7种病原体常规PCR扩增的反应条件
Table 4  Amplification condition of conventional PCR for 7 pathogens causing BRD

反应步骤

Reaction steps

反应时间

Reaction time

病原

Pathogens

预变性 Predenaturation 5 min M.h，IBRV
10 min M.b，P.m，BPIV-3，BRSV
变性 Denaturation 30 s M.h，BPIV-3，BRSV
1 min M.b，P.m，IBRV
退火 Annealing 30 s M.h，IBRV，BPIV-3，BRSV
1 min M.b，P.m

延伸

Extension

30 s M.b
45 s M.h
1 min P.m，IBRV，BPIV-3，BRSV
最后延伸 Final extension 5 min M.h
8 min M.b
10 min P.m，IBRV，BPIV-3，BRSV

2 结果与分析

2.1 M.h重组质粒的构建

提取M.h菌液总DNA，应用特异性引物进行PCR扩增，获得M.h的GCP基因部分片段，与目的片段大小（171 bp）一致。经回收、连接、转化，阳性克隆提取质粒，进行PCR鉴定和测序鉴定，结果显示与预期一致。表明M.h重组质粒构建成功，经检测浓度，换算成拷贝数为3.07×1010 拷贝/μL，可作为质粒标准品。

2.2 多联荧光定量PCR体系反应条件的确定

经过优化，将7种病原分为3管进行扩增，其中管1包括P.m和M.h，管2包括BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c，管3包括M.b和IBRV。每种病原扩增的引物浓度和探针浓度有所不用，最终形成20 μL的反应体系，并在同一反应条件下进行扩增。多联荧光定量PCR的最佳反应体系及条件如表5所示。

表5  多联荧光定量PCR扩增体系及条件
Table 5  Amplification system and condition of multiple qPCR

分管

Tubes

病原体

Pathogens

引物浓度/（nmol/L）Primer concentrations探针浓度/（nmol/L）Probe concentrations2×qPCR mix/μL

双蒸水

ddH2O

反应条件

Reaction conditions

管1

Tube 1

P.m 250 350 10

补足至20 μL

Refill to 20 μL

95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环

95 ℃ 5 min 1 cycle,95 ℃ 10 s and 60 ℃ 30 s， 40 cycles

M.h 350 350

管2

Tube 2

BRSV 250 350 10

补足至20 μL

Refill to 2 0 μL

BPIV-3a 400 250
BPIV-3c 350 300

管3

Tube 3

M.b 250 350 10

补足至20 μL

Refill to 20 μL

IBRV 350 250

2.3 多联荧光定量PCR标准曲线的建立

将M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c的质粒标准品10倍系列稀释成108~104拷贝/μL，等比例混合后作为模板进行扩增，以扩增循环数为横坐标，相对荧光强度即RFU值（relative fluorescence units）为纵坐标，获得多联荧光定量PCR的扩增曲线（图1A~G），以质粒DNA模板浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，建立多联qPCR体系标准曲线（图1H）。结果显示，7种病原标准曲线的相关系数R2均在0.99以上，表明各种标准品的起始模板数和Ct值之间均呈现良好的线性关系。

图1  多联荧光定量PCR对牛呼吸疾病综合征7种病原体的扩增曲线（A~G）和标准曲线（H）

Fig.1  Amplification curves（A-G） and standard curves（H） of multiple qPCR used to amplify the 7 pathogens associated with bovine respiratory diseases complex

A： M.b；B： P.m； C： M.h； D： IBRV； E： BRSV； F： BPIV-3a； G： BPIV-3c； H： 标准曲线 Standard curves.

2.4 特异性分析

用建立的多联 qPCR方法对牛呼吸疾病综合征7种病原体或其常见血清型和基因型的培养物进行检测，模板为各病原体的基因组DNA或cDNA，结果如图2所示，只有M.b、P.m-A、P.m-B、P.m-D、P.m-F、M.h-A1、M.h-A6、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c的基因组DNA/cDNA出现扩增曲线，而其他常见病原体和相关病原体如昏睡嗜组织杆菌、摩氏摩根菌、猪链球菌、停乳链球菌、无乳支原体、牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、副猪嗜血杆菌、伪狂犬病毒的DNA/cDNA及阴性对照均无扩增，表明所建立的多联qPCR方法特异性好。

图2  牛呼吸疾病综合征七病原多联 qPCR的特异性分析

Fig. 2  Specific test of the multiple qPCR for the seven pathogens causing bovine respiratory disease complex

2.5 敏感性分析

以10倍梯度稀释的104~100拷贝/μL的7种病原质粒DNA为模板，按照建立的多联qPCR方法对5个梯度模板进行扩增，结果如图3所示，M.h和BPIV-3c的质粒最低检测限为101 拷贝/μL，M.b、P.m、IBRV、BPIV-3a与BRSV的质粒最低检测限均为102 拷贝/μL。

图3  牛呼吸疾病综合征7种病原多联 qPCR分析灵敏度检测

Fig. 3  Analytic sensitivity test of multiple qPCR for seven pathogens of bovine respiratory disease complex

A： M.b；B： P.m；C： M.h；D： IBRV；E： BRSV；F： BPIV-3a；G： BPIV-3c.

2.6 重复性分析

以106~104 拷贝/μL稀释的3个梯度质粒DNA为模板，按照建立的多联qPCR检测方法分别进行3次批内试验和3次批间试验，结果如表6所示，批内试验变异系数小于2.5%，批间试验变异系数小于5.5%，表明该方法重复性较好。

表6  多联荧光定量PCR重复性分析
Table 6  Repeatability analysis of the multiple qPCR
病原Pathogens

模板浓度/（copies/μL）

Template concentration

批内重复 Repetition of intra-assay批间重复 Repetition of inter-assay
平均Ct标准差SDCV/%平均Ct标准差SDCV/%
M.b 106 23.61 0.18 0.70 23.99 0.61 2.50
105 26.23 0.08 0.29 26.43 0.24 0.89
104 29.72 0.07 0.23 30.16 0.60 1.90
P.m 106 19.80 0.26 1.29 20.13 0.29 1.42
105 23.57 0.49 0.20 23.70 0.13 0.50
104 26.67 0.22 0.80 26.92 0.21 0.79
M.h 106 19.92 0.04 0.18 19.96 0.04 0.20
105 23.34 0.09 0.39 23.3 0.17 0.74
104 26.54 0.20 0.75 26.76 0.24 0.90
IBRV 106 24.26 0.37 1.50 24.49 0.32 1.30
105 27.38 0.15 0.56 28.02 0.47 1.60
104 30.80 0.90 0.29 31.11 0.23 0.73
BRSV 106 22.76 0.47 2.09 21.92 0.61 2.81
105 26.22 0.03 0.10 25.93 0.46 1.80
104 30.41 0.28 0.93 29.75 0.51 1.72
BPIV-3a 106 20.92 0.68 0.03 20.50 1.06 5.19
105 25.21 0.62 2.46 25.24 0.67 2.66
104 29.27 0.05 0.17 29.30 0.12 0.42
BPIV-3c 106 21.89 0.34 1.58 22.37 0.59 2.67
105 25.52 0.98 0.38 26.06 1.21 4.65
104 28.61 0.18 0.64 29.32 0.89 3.03

2.7 临床样品检测

将临床样品提取核酸后，利用本研究所建立的多联荧光定量PCR方法与常规PCR方法进行检测，结果见表7。本方法共检测到M.b阳性样品32份（27.83%）、P.m阳性样品41份（36.65%）、M.h阳性样品29份（25.22%）、IBRV阳性样品11份（11.30%）、BRSV阳性样品1份（0.95%）、 BPIV-3c阳性样品9份（8.57%），阳性检出率均高于常规PCR法。另外，该多联荧光定量PCR方法还可用于多病原混合感染样品检测，结果见表8，共检测到11种混合感染模式，由M.b与其他病原体的混合感染占72.7%（8/11），M.b/P.m混合感染的检出率最高，占60%（18/30），M.b、P.m、M.h在混合感染中出现率排前三，其占比分别为73.3%（22/30）、73.3%（22/30）和43.3%（13/30）；其次为IBRV，占26.7%（8/30）；BPIV-3c 占13.3%（4/30）。

表7  临床样品单病原检测结果
Table 7  Detection result of single pathogen in clinical samples

病原

Pathogens

样品数

Sample No.

多联荧光定量PCR检测

Detection of multiple qPCR

常规PCR

Detection of conventional PCR

阳性样品数

No. of positive sample

阳性率/%

Positivity

阳性样品数

No. of positive samples

阳性率/%

Positivity

M.b 115 32 27.82 10 8.69
P.m 115 41 35.65 33 28.69
M.h 115 29 25.22 9 7.83
IBRV 105 13 11.30 0 0
BRSV 105 1 0.95 0 0
BPIV-3a 105 0 0 0 0
BPIV-3c 105 9 8.57 6 5.71
表8  临床样品多病原混合感染检测结果
Table 8  Detection results of multiple pathogen coinfection in clinical samples

病原

Pathogens

样品数

Sample No.

阳性样品数

No. of positive samples

阳性率/%

Positivity

M.b+P.m 115 12 10.43
M.b+M.h 115 2 1.74
P.m+M.h 105 2 1.90
P.m+IBRV 105 2 1.90
M.h+IBRV 105 3 2.86
M.h+BPIV-3c 105 1 0.95
M.b+P.m+M.h 115 2 1.74
M.b+P.m+IBRV 105 2 1.90
M.b+M.h+BPIV-3c 105 1 0.95
M.b+BRSV+BPIV-3c 105 1 0.95
M.b+P.m+M.h+IBRV 105 1 0.95
M.b+P.m+M.h+IBRV+BPIV-3c 105 1 0.95

3 讨论

由于BRD多病原混合感染增加了诊断的复杂性，临床上急需一种准确、快速且能同时检测多种病原的检测方法。本研究所建立的致BRD七种病原的多联荧光定量PCR检测方法，对M.h最低检测限为10 copies/μL，与早期李富祥等［

18］建立的M.h TaqMan qPCR方法敏感性一致，对牛副流感病毒3c基因型的最低检测限为10 copies/μL，其余5种病原的最低质粒检测限均为102 copies/μL，其中BRSV的最低检测限与齐力格尔［19］建立的BRSV TaqMan qPCR方法相比高10倍，M.b的最低检测限与李建等［20］建立的M.b TaqMan qPCR方法相比高10倍，IBRV的最低检测限与任强林［21］建立的IBRV TaqMan qPCR方法相比高10倍，P.m的最低检测限与许腾林等［22］建立的P.m TaqMan qPCR方法相比高10倍，虽然有些病原的最低检测限相较于单病原 TaqMan qPCR检测方法有所降低，但在目前报道的多病原联合检测同类研究中，已处于较高的技术水平。

应用该方法对临床100余份患有呼吸疾病的牛的鼻拭子进行检测，结果显示，该方法对7种病原阳性检出率均高于文献报道的常规PCR法。另外，采用国家标准的IBRV qPCR检测方法（GB/T 27981-2011）及有行业标准的M.b PCR方法 （NY/T 3234-2018）对所有样品检测，本研究建立的方法与其检测符合率IBRV为97.14%，而M.b符合率（80%）较低，可能是由于qPCR敏感性高于常规PCR所致。

本研究对临床样品检测结果显示，7种病原的混合感染率达26.08%，证实了BRD的混合感染特征。在混合感染中，M.b、P.m、M.h是位于前3位的病原体，在BRD防控措施研发中，应给予高度重视。本研究中7种病原体出现频率由高到低的顺序分别为P.m、M.b、M.h、IBRV、BPIV-3c和BRSV，与其他报道的各病原顺位存在差异，这表明不同国家和地区的患病牛群BRD的优势病原所占具体比例存在一定差异性［

23］。本方法的另一优势是可同时对BPIV-3国内流行主要基因型（a型和c型）进行分型鉴定。临床样本的检测结果显示，BPIV-3c的流行率大于BPIV-3a，这一结果与路荣［24］结论相同。

综上，本研究建立的七病原多联荧光定量PCR检测方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，为M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c这7种病原的联合检测以及BRD快速检测和流行病学调查等提供了有效的技术手段，具有重要的应用价值。

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