摘要
为建立一种能够快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）的可视化LAMP检测法，利用LAMP引物设计软件，以溶血性曼氏杆菌保守基因lktC序列设计内引物、外引物及环引物，对其反应温度、M
溶血性曼氏杆菌 （Mannheimia haemolytica） 是引起牛呼吸道疾病综合征的机会性病原，在运输等应激环境或其他病原混合感染情况下，可侵袭动物肺部引起呼吸道疾病，主要表现为呼吸困难、食欲下降、精神沉郁、发热和流鼻涕等，严重的感染48 h后死
目前，用于溶血性曼氏杆菌病诊断的方法主要包括普通PC
环介导等温扩增 （loop-mediated isothermal amplification， LAMP） 是一种类似于PCR的核酸扩增方法，可以在恒温条件下（65 ℃左右）快速扩增靶基因，具有灵敏、便捷等优点，能够满足普通农场检测的需
LktC（leukotoxin C）基因是由溶血性曼氏杆菌产生的一种具有酰化作用的钙依赖性细胞毒素，属于重复子毒素（repeat in toxin ， RTX）家族，高度保守，能够作为溶血性曼氏杆菌较好的诊断靶点。因此，本研究以lktC基因为基础，建立了一套能够用于牛溶血性曼氏杆菌检测的可视化LAMP方法，以期为我国牛溶血性曼氏杆菌病的防控提供新的技术支持。
本研究中所用到的牛溶血性曼氏杆菌（A1、A2、A6型）菌株、牛多杀性巴氏杆菌（A型、B型、F型）、牛支原体、牛鼠伤寒沙门氏菌、牛产肠毒素型大肠杆菌、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛传染性鼻气管炎病毒等均由华中农业大学农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室反刍动物疾病研究室分离并保存。
lktC重组质粒及溶血曼氏杆菌灭活疫苗由华中农业大学农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室反刍动物疾病研究室构建、制备并保存。
本研究所使用的LB/Amp培养基、LB/Amp平板培养基和TSB培养基均按说明书常规配制。主要试剂Bst 2.0 DNA Polymerase、MgSO4、dNTPs购自Bio-Rad Laboratories；Eva Green20×染料购自Biotium；SYBR Green I染料、 6×Loading buffer购自南京诺唯赞生物有限公司。
依据溶血性曼氏杆菌lktC基因序列（GenBank登录号：CP017484.1）进行引物设计。包含2条内引物（FIP/BIP），2条外引物（F3/B3）和1条环引物（LB），引物信息如
| 引物名称 Primer name | 引物序列 Primer sequence (5′-3′) |
|---|---|
| 上游内部引物Forward inner primer (FIP) | TTGTTGCAGCAGGGCAGGAGCGACCAGTTAGATAACCATAGCG |
| 下游内部引物Backward inner primer (BIP) | AACCAGAGCGGTGGCCTCTA-AGGTGGTGTTGTTACGACTG |
| F3引物 Forward 3 (F3) | CAATCGCATCCGGGCTAA |
| B3引物 Backward 3 (B3) | TCCGGTACGGTTCAGCAA |
| 环状引物Loop backward (LB) | CATCGTCTTCCGGCACAA |
1）含有lktC基因的重组质粒的制备。在pUC 57载体上插入lktC基因（GenBank登录号：CP017484.1）238 bp片段，构成lktC基因重组质粒。将含有lktC质粒的菌液在LB/Amp液体培养基中37 ℃、180 r/min培养12 h，用Omega D6943-02质粒小提试剂盒提取DNA作为阳性对照（提取步骤参照试剂盒说明书），-20 ℃保存备用。
2）溶血性曼氏杆菌DNA的制备。将溶血性曼氏杆菌接种于TSB培养基中，37 ℃、180 r/min 培养6 h；依照参考文献［
1）反应条件和反应体系的优化。本方法的初始反应体系为10× Isothermal Amlification Buffer 2.5 μL、MgSO4（100 mmol/L） 1.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）3.5 μL、LB（10 μmol/L）1.0 μL、FIP（10 μmol/L）4.0 μL、BIP（10 μmol/L）4.0 μL、F3（10 μmol/L）0.5 μL、B3（10 μmol/L）0.5 μL、Bst 2.0 DNA 聚合酶（8 000 U/mL）1 μL、DNA模板1 μL以及ddH2O 5.5 μL。采用控制变量法对反应条件和反应体系进行优化，温度分别以60.6、62.5、65.0、67.0、和68.2 ℃进行反应；M
依据荧光定量PCR所确立的各项体系完成反应液的配制。随后在反应液上方滴加30 µL液体石蜡进行封闭，并在反应管管盖上滴加0.2 µL SYBR Green Ⅰ 染料。将反应管置于68.2 ℃恒温水浴锅中水浴40 min，反应结束后轻甩反应管，使染料与反应液充分混合，在自然光下观察颜色变化。如反应管中溶液由无色变为荧光绿色则判为阳性，由无色变为橙黄色则判为阴性。
2）特异性检测。采用本文“材料与方法1.1”所述的15种病原进行特异性检测。提取该15种病原的DNA作为模板，用最终优化后的反应体系分别对这15种病原进行检测，根据反应管中颜色的变化判断可视化LAMP的特异性。牛溶血性曼氏杆菌（A1、A2、A6型）菌株检测为阳性，其他病原检测为阴性即为特异性良好。
3）灵敏度检测。分别以7.
copies/μL质粒DNA以及6.7×1
1）反应条件的优化。在25 μL体系中，对温度、M
图1 可视化LAMP方法的温度（A），M
Fig.1 Temperature （A） ， M
即优化后最适反应体系（25 μL）及条件为：2.5 μL 10× Isothermal Amlification Buffer、6 mmol/L MgSO4（1.5 μL、100 mmol/L的MgSO4）、1.6 mmol/L dNTPs（4.0 μL、10 mmol/L的dNTPs）、0.4 μmol/L LB（1.0 μL、10 μmol/L的LB）、4.0 μL 10 μmol/L的FIP、4.0 μL 10 μmol/L的BIP、0.5 μL 10 μmol/L的F3、0.5 μL 10 μmol/L的B3、1 μL Bst 2.0（8 000 U/mL）、1 μL重组质粒或细菌模板、5 μL ddH2O。
2） 特异性检测。用所建立的可视化LAMP方法对“材料与方法1.1”所述的15种病原进行检测，结果显示，仅溶血性曼氏杆菌A1、A2和A6所对应的2~4号反应管中出现可视化颜色变化，呈荧光绿色，判为阳性，其他病原所对应的反应管均为橙黄色，判定为阴性；在琼脂糖凝胶图像中，仅2~4泳道有典型的梯状条带。结果表明，所建立的可视化LAMP方法具有较高的特异性，且能够检测溶血性曼氏杆菌A1、A2和A6型，与其他病原不发生交叉反应（
图2 可视化LAMP的特异性检测
Fig.2 Specificity of visual LAMP
M： DL 2000 DNA marker；1：阴性对照；2~4：溶血性曼氏杆菌A1型、A2型、A6型；5~7：多杀性巴氏杆菌A型、B型、F型；8：牛支原体；9：鼠伤寒沙门氏菌；10：产肠毒素型大肠杆菌；11：副流感病毒3型；12：牛呼吸道合胞体病毒；13：牛病毒性腹泻病毒1型；14：牛轮状病毒；15：牛冠状病毒；16：牛传染性鼻气管炎病毒。M： DL 2000 DNA marker； 1： Negative control； 2-4： M. haemolytica A1，A2 and A6； 5-7： P. multocida A，B and F； 8： M. bovis； 9： Salmonella typhimurium； 10： Enterotoxigenic E. coli； 11： BPIV-3； 12： BRSV； 13： BVDV-1； 14： BRV； 15： BcoV； 16： IBRV.
3） 灵敏度检测。将制备的溶血性曼氏杆菌A6-ZMD菌液和lktC重组质粒分别以10倍倍比稀释检测可视化LAMP的灵敏度，同时检测PCR方法的灵敏度用作对照。结果显示，所建立的可视化LAMP方法检测菌液的检测限为6.7×1
图3 可视化LAMP检测A6-ZMD菌液灵敏度
Fig.3 Sensitivity of visual LAMP to detect bacterium
M： DL 2000 DNA marker； 1 ：阴性对照 Negative control； 2-10：6.7×1
图4 可视化LAMP检测lktC质粒灵敏度
Fig.4 Sensitivity of visual LAMP to detect lktC plasmid
M： DL 2000 DNA marker； 1：阴性对照 Negative control； 2-12：7.9×1
普通PCR方法检测菌液的检测限为6.7×1
图5 PCR检测A6-ZMD菌液的灵敏度
Fig.5 Sensitivity of PCR to detect A6-ZMD bacterium
M： DL 2000 DNA marker； 1：阴性对照Negative control； 2-11：6.7×1
图6 PCR检测lktC基因的灵敏度
Fig.6 Sensitivity of PCR to detect lktC
M： DL 2000 DNA marker； 1：阴性对照 Negative control；2-12： 7.9×1
同时采用可视化LAMP和PCR方法对已知背景的小鼠肺组织进行检测。结果显示，2种方法均能够准确检测出15份阴性（
图7 可视化lktC-LAMP方法和普通PCR方法检测阴性小鼠肺组织
Fig.7 Comparison of visual LAMP and PCR to detect negative mice tissues
M： DL2000 DNA marker； 1~5：不同正常小鼠的肺组织； 6~10：免疫后7 d的不同小鼠肺组织； 11~15：免疫后21 d的不同小鼠肺组织；16：阴性对照； 17：阳性对照。M： DL2000 DNA marker； 1-5： Different lung tissues of normal mice； 6-10： Lung tissues of mice 7 d after immunization； 11-15： Lung tissues of mice 21 d after immunization； 16： Negative control； 17： Positive control.
图8 可视化LAMP方法和普通PCR方法检测阳性小鼠肺组织
Fig.8 Comparison of visual LAMP and PCR to detect positive mice tissues
M： DL2000 DNA marker；1~5：攻毒后未死亡的不同小鼠肺组织；6~15：攻毒后死亡的不同小鼠肺组织；16：阴性对照；17：阳性对照。M： DL2000 DNA marker；； 1-5：Different lung tissues of mice that did not die after chllenged； 6-15： Different lung tissues of dead mice after chllenged；16： Negative control； 17： Positive control.
可视化LAMP相较普通PCR法，敏感性和特异性均更高，表明该方法用作溶血性曼氏杆菌更为准确，在现场快速检测领域具有很好的应用前景。
可视化LAMP通过添加染料观察颜色变化进行结果的判定，目前常用的染料包括SYBR Green Ⅰ、HNB等。SYBR Green Ⅰ 一般在反应结束后加入，否则影响LAMP反应的效
本研究建立的可视化LAMP方法检测溶血性曼氏杆菌A6-ZMD菌液的灵敏度下限为6.7×1
参考文献References
谢倩茹，姜鹏，彭清洁，等.牛溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌A型、B型的比较鉴定研究［J］.中国奶牛，2015（14）：48-54.XIE Q R，JIANG P，PENG Q J，et al.Study on comparative identification for cattle Mannheimia haemolytica，Pasteurella multocida type A and B strains［J］.China dairy cattle，2015（14）：48-54 （in Chinese with English abstract）. [百度学术]
NOYES N R，BENEDICT K M，GOW S P，et al.Mannheimia haemolytica in feedlot cattle：prevalence of recovery and associations with antimicrobial use，resistance，and health outcomes［J］.Journal of veterinary internal medicine，2015，29（2）：705-713. [百度学术]
刘心，彭清洁，彭永崇，等.牛溶血曼氏杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］.中国兽医学报，2020，40（6）：1131-1135.LIU X，PENG Q J，PENG Y C，et al.Isolation，identification and drug sensitivity test of Mannheimia haemolytica in cattle［J］.Chinese journal of veterinary science，2020，40（6）：1131-1135 （in Chinese with English abstract）. [百度学术]
KLIMA C L，ZAHEER R，BRIGGS R E，et al.A multiplex PCR assay for molecular capsular serotyping of Mannheimia haemolytica serotypes 1，2，and 6［J］.Journal of microbiological methods，2017，139：155-160. [百度学术]
刘晓丹.六种牛源致病性细菌多重PCR检测方法的建立［D］.哈尔滨：东北农业大学，2013.LIU X D.Development of multiplex PCR for detection of pathogenic bacteria［D］.Harbin：Northeast Agricultural University，2013 （in Chinese with English abstract）. [百度学术]
李富祥，李华春，洪琼花，等.溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用［J］.中国兽医科学，2016，46（10）：1213-1218.LI F X，LI H C，HONG Q H，et al.Development and application of TaqMan real-time PCR assay for the detection of Mannheimia haemolytica［J］.Chinese veterinary science，2016，46（10）：1213-1218 （in Chinese with English abstract）. [百度学术]
许淑玉.牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌多重PCR-ELISA检测方法的建立及初步应用［D］.长春：吉林农业大学，2018.XU S Y.Development and primary application of a multiplex PCR-ELISA for the identification of Mycoplasma bovis，Pasteurella mutocida and Mannheimia haemolytica［D］.Changchun：Jilin Agricultural University，2018 （in Chinese with English abstract）. [百度学术]
谢佳芮，寇美玲，苗海生.环介导等温扩增技术的最新研究进展［J］.畜牧与兽医，2021，53（2）：119-125.XIE J R，KOU M L，MIAO H S.Latest progress in research on loop-mediated isothermal amplification［J］.Animal husbandry & veterinary medicine，2021，53（2）：119-125（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
李占鸿，朱沛，宋子昂，等.蓝舌病病毒群特异性RT-LAMP检测方法的建立与初步应用［J］.畜牧兽医学报，2021，52（8）：2244-2253.LI Z H，ZHU P，SONG Z A，et al.Establishment and application of a group specific reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification method of bluetongue virus［J］.Acta veterinaria et zootechnica sinica，2021，52（8）：2244-2253（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
白榕，白琳琳，汪少芸，等.LAMP扩增产物检测方法研究进展及基因编辑技术在其中的应用［J］.农业生物技术学报，2021，29（10）：2016-2030.BAI R，BAI L L，WANG S Y，et al.Research progress of LAMP amplicons detection method and the application of gene editing technology［J］.Journal of agricultural biotechnology，2021，29（10）：2016-2030（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
SINGH R，SINGH D P，SAVARGAONKAR D，et al.Evaluation of SYBR green I based visual loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assay for genus and species-specific diagnosis of malaria in P.vivax and P.falciparum endemic regions［J］.Journal of vector borne diseases，2017，54（1）：54-60. [百度学术]
ZHANG Y Q，SHAN X X，SHI L，et al.Development of a fimY-based loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Salmonella in food［J］.Food research international，2012，45（2）：1011-1015. [百度学术]
李军，吴翠兰，彭昊，等.一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及其应用：CN108660192A［P］.2018-10-16.LI J，WU C L，PENG H，et al.LAMP （loop-mediated isothermal amplification） primer group for quickly detecting mannheimia haemolytica and application thereof：CN108660192A［P］.2018-10-16（in Chinese）. [百度学术]