摘要
为建立雷公藤种植过程中常用农药的残留含量检测方法,采用快速样品前处理结合超高效液相色谱-串联质谱法(quick,easy, cheap,effective,rugged and safe/ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,QuEChERS/UPLC-MS/MS)测定雷公藤及根际土壤中辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多杀菌素的含量。样品中加入适量的水浸润后用乙腈超声提取,N-丙基乙二胺(PSA)吸附净化,利用优化后的UPLC-MS/MS方法进行检测,基质外标法定量。结果显示,3种农药在根样基质中的检出限(LOD)为0.001~0.714 μg/kg,定量限(LOQ)为0.002~2.380 μg/kg;在土壤基质中的检出限(LOD)为0.002~0.810 μg/kg,定量限(LOQ)为0.006~2.410 μg/kg。线性关系、回收率和相对标准偏差均符合农药残留检测的相关规定。结果表明,该方法能满足雷公藤及根际土壤中3种农药残留含量的快速检测要求。
雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是卫矛科(Cleastraceae)雷公藤属植物,是我国传统的中药材之一,其主要活性成分为萜类和生物碱类化合物,具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗菌、止痛等多种作
目前,常见的检测中药材中农药残留的方法主要包括色谱法、色谱-质谱联用技术、毛细管电泳法、免疫分析法和生物传感器技术等,其中色谱和质谱法在实际应用中比较广泛。中药材基质复杂,且待测农药大多数在高温下不稳定,所以液质联用技术成为了测定农药残留的主导技
QuEChERS法是在固相萃取基础上开发的一种新型样品前处理技
目前,针对我国雷公藤种植生产过程中常用的3种农药残留检测方法报道较少,且目前我国没有雷公藤药材中的农药残留标准。本研究通过快速样品前处理结合超高效液相色谱-串联质谱(QuEChERS/UPLC-MS/MS)法测定雷公藤及根际土壤中辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多杀菌素3种农药残留含量,并与相关国际标准进行对比,旨在为3种农药在雷公藤及根际土壤中的残留检测提供方法指导, 并为我国尽快制订雷公藤中药材中的农药残留标准提供一定的参考。
乙酸铵(色谱纯),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙腈(色谱纯),中国武汉弗顿控股有限公司;乙腈和甲醇(质谱纯),美国Fisher公司;无水硫酸镁(MgSO4,分析纯),中国上海麦克林生化科技有限公司;氯化钠(NaCl,分析纯),德国BioFro公司;N-丙基乙二胺(PSA, 40~63 μm),美国Agela Technologies公司;乙基多杀菌素原药(100 mg,纯度为88.28%),德国Dr. Ehrensorfer公司;氯氰菊酯标准溶液(1 000 mg/L,丙酮中)和辛硫磷标准溶液(100 mg/L,丙酮中),坛墨质检科技股份有限公司。
雷公藤根样、土壤样品于2021年11月13日采集于湖北省阳新县平原村雷公藤种植基地 (115°E, 29°N)。随机取30株雷公藤作为检测植株样品,其中根样取自于所选定的雷公藤植株地下10~20 cm处,土样选择对应部位的根际土壤(黄棕壤,有机质17.88 g/kg,全氮0.46 g/kg,全磷0.86 g/kg,全钾6.29 g/kg,碱解氮84.35 mg/kg,速效磷25.92 mg/kg,pH 4.94)。
超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(TSQ Altis™),美国Thermo Fisher Scientific公司;色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm),美国Waters公司;FW80高速粉碎机、101-AB电热鼓风干燥箱,天津市泰斯特仪器有限公司;BX3200H超声波清洗仪,上海新苗医疗器械制造有限公司;AR223CN分析天平,奥豪斯仪器(上海)有限公司;B-20R型冷冻离心机,德国NACHT公司;MX-S型旋涡混合器,美国Scilogex公司。
将雷公藤根样洗净,擦净表面水分后于65 ℃烘箱中烘干6 h,粉碎,过孔径230 μm筛,试验前于65 ℃烘箱中烘干4 h,备用。土壤样品自然风干,除去碎石、杂草和植物根茎等杂物,过孔径280 μm筛,备用。准确称取雷公藤根样和土壤样品各2 g(精确至0.01 g),分别置于50 mL 离心管中,各加入去离子水4 mL,充分浸润后,加入乙腈4 mL,涡旋混匀1 min,超声30 min后依次加入氯化钠0.4 g和无水硫酸镁1.6 g,再次涡旋2 min后4 000 r/min离心5 min。精密量取上清液2 mL于15 mL离心管中,分别加入N-丙基乙二胺0.1 g和无水硫酸镁0.3 g,旋涡1 min,于4 ℃、5 000 r/min离心5 min,取上清液过0.22 μm有机膜,待测。
乙基多杀菌素标准储备溶液:准确称取乙基多杀菌素标准品10 mg(精确至 0.1 mg)至10 mL容量瓶中,加入乙腈溶解,定容至刻度,摇匀,配制成1 000 mg/L的标准储备溶液,在4 ℃冰箱中保存,待用。空白基质溶液:分别准确称取未施药的雷公藤根样和土壤样品各2 g(精确至0.01 g),按照本文“1.3”方法进行样品前处理,得到根样空白基质溶液和土壤空白基质溶液。空白基质标准工作溶液:用空白基质溶液分别稀释3种农药标准品溶液,配制一系列浓度的空白基质标准工作溶液,用于做基质匹配校准工作曲线。
色谱条件:色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm);柱温40 ℃;进样量1 μL;流速0.4 mL/min;流动相 A:乙腈;流动相B:5 mmol/L乙酸铵溶液;梯度洗脱程序:0 min,5% A,95% B;10 min,99% A,1% B;13 min,99% A,1% B;13.1 min,5% A,95% B;15 min,5% A,95% B。
质谱条件:Thermo Fisher超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(TSQ Altis™)检测,电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI);正离子扫描模式;选择反应监测模式(selective reaction monitoring,SRM);毛细管电压3.5 kV;离子传输线温度325 ℃;雾化温度350 ℃;辅助气和鞘气均为N2,辅助气流速10 mL/min;鞘气流速40 mL/min。优化后的各目标化合物的质谱参数见
化合物 Compound | 分子式Molecular formula | 母离子/(m/z) Parent ion | 子离子/(m/z) Daughter ion | 碰撞能量/V Collision energy | 保留时间/min Retention time |
---|---|---|---|---|---|
辛硫磷 Phoxim | C12H15N2O3PS | 299 |
271/12 | 18 | 9.1 |
氯氰菊酯 Cypermethrin | C22H19Cl2NO3 | 433.2 |
119/19 | 21 | 10.3 |
乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | C42H69NO10 | 748.5 |
203.1/142. | 23 | 10.8 |
乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | C43H69NO10 | 760.5 |
203.1/142. | 25 | 11.0 |
注: *定量离子。Note: * Quantitative ion.
考察了2种超高效液相色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm)在乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-5 mmol/L的乙酸铵溶液2种流动相和梯度洗脱条件下分离目标物的情况。3种农药在不同的色谱柱和流动相条件下的保留时间、峰形和分离情况见
条件 Conditions | 保留时间/min Retention time | 峰形Peak shape | 分离度Resolution | |||
---|---|---|---|---|---|---|
辛硫磷Phoxim | 氯氰菊酯Cypermethrin | 乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | 乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | |||
1 | 9.1 | 9.1 | 9.0 | 9.6 | 较好 Better | 较好 Better |
2 | 10.3 | 10.6 | 10.2 | 10.7 | 差 Bad | 较好 Better |
3 | 10.8 | 10.8 | 10.8 | 10.6 | 较好 Better | 差 Bad |
4 | 11.0 | 11.0 | 11.0 | 11.0 | 差 Bad | 差 Bad |
注: 1:HSS T3 (1.8 μm)色谱柱和乙腈-5 mmol/L的乙酸铵溶液为流动相;2:HSS T3 (1.8 μm)色谱柱和乙腈-0.1%甲酸水为流动相;3:BEH C18 (1.7 μm)色谱柱和乙腈-5 mmol/L的乙酸铵溶液为流动相;4:BEH C18 (1.7 μm)色谱柱和乙腈-0.1%甲酸水为流动相。Note: 1: HSS T3 (1.8 μm) column and acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate solution as mobile phase; 2: HSS T3 (1.8 μm) column and acetonitrile-0.1% formic acid water as mobile phase; 3: BEH C18 (1.7 μm) column and acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate solution as mobile phase; 4: BEH C18 (1.7 μm) column and acetonitrile-0.1% formic acid water as mobile phase.
按照本文“1.4”方法配制一系列空白基质标准工作溶液,以浓度为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y),线性回归分析,拟合得各农药的基质匹配线性回归方程以及相关系数。如
化合物 Compound | 空白基质 Blank matrix | 线性方程 Linear equation | 相关系数 Correlation coefficient | 检出限/(μg/kg) LOD | 定量限/(μg/kg) LOQ |
---|---|---|---|---|---|
辛硫磷 Phoxim | 根 Root | y = 9536.8x-1259.0 | 0.999 9 | 0.012 | 0.041 |
土壤 Soil | y = 9176.5x-2353.5 | 0.999 9 | 0.015 | 0.046 | |
氯氰菊酯 Cypermethrin | 根 Root | y = 442.21x-3871.8 | 0.999 2 | 0.714 | 2.380 |
土壤 Soil | y = 395.18x+1184.4 | 0.999 8 | 0.810 | 2.410 | |
乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | 根 Root | y = 98936x+172421 | 0.999 6 | 0.001 | 0.002 |
土壤 Soil | y = 115432x+69355 | 0.999 9 | 0.002 | 0.006 | |
乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | 根 Root | y = 29800x-9730.4 | 0.999 9 | 0.006 | 0.021 |
土壤 Soil | y = 25398x-1446.4 | 0.999 9 | 0.007 | 0.022 |
以信噪比(S/N)为10和3时对应的空白基质标准溶液的浓度为定量限(LOQ)和检出限(LOD),3种农药的定量限和检出限结果如
化合物 Compound | GB 2763—2021 (参考枸杞干Refer to dried Matrimony vine) | 中国药典(2020版)Chinese pharmacopoeia 2020 | 美国药典(40版)PharmacopeiaUSP 40 | 欧盟药典(9.2版)Europeanpharmacopeia 9.2 | 日本药典(2017版)Japanese pharmacopoeia 2017 | 韩国药典(10版)Koreanpharmacopeia 10 |
---|---|---|---|---|---|---|
辛硫磷 Phoxim | - | - | 0.01 | 0.01 | 0.01 | - |
氯氰菊酯 Cypermethrin | 2 | - | 1 | 1 | 1 | 0.5 |
乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | 1 | - | 0.01 | 0.01 | 0.01 | - |
乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | 1 | - | 0.01 | 0.01 | 0.01 | - |
注: “-” 表示该农药在相应标准中无最大残留限量规定。Note:“-” indicates that there are no pesticide maximum residue limits in the corresponding standard.
3种农药在雷公藤根和土壤样中的回收率试验结果见
化合物 Compound | 添加水平/(μg/kg) Added levels | 平均回收率/% Average recovery | 相对标准偏差/% RSD | ||
---|---|---|---|---|---|
根 Root | 土壤 Soil | 根 Root | 土壤 Soil | ||
辛硫磷 Phoxim | 50 | 108.31 | 103.89 | 2.39 | 5.21 |
5 | 86.75 | 102.11 | 5.12 | 4.89 | |
1 | 88.36 | 113.08 | 5.67 | 3.98 | |
氯氰菊酯 Cypermethrin | 2 000 | 107.48 | 106.31 | 3.50 | 4.05 |
200 | 108.23 | 97.44 | 2.56 | 4.32 | |
5 | 105.78 | 96.69 | 3.86 | 3.28 | |
乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | 1 000 | 104.19 | 85.22 | 4.71 | 4.23 |
50 | 97.47 | 86.97 | 3.65 | 3.97 | |
1 | 106.34 | 97.05 | 4.34 | 5.55 | |
乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | 1 000 | 108.24 | 86.56 | 4.93 | 4.89 |
50 | 90.45 | 88.87 | 3.45 | 3.68 | |
1 | 107.17 | 98.09 | 5.02 | 5.38 |
对采集于华润三九(黄石)药业有限公司雷公藤GAP种植示范基地(湖北省阳新县平原村)的雷公藤根部样品和土壤样品各30份进行检测,结果见
化合物 Compound | 根样 Root samples | 土壤样品 Soil samples |
---|---|---|
辛硫磷 Phoxim | 0.010~0.037 | ND |
氯氰菊酯 Cypermethrin | 2.940~6.540 | ND |
乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | <LOQ~0.005 | ND |
乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | <LOQ~0.004 | ND |
注Note:ND表示未检出Not detected.
本研究检测的3种农药是雷公藤种植过程中最常用的农药,其中辛硫磷属于有机磷类农药,见光易分解、残留期短、残留危害小,适合施入土中,防止地下害虫。乙基多杀菌素(XDE-175-J, XDE-175-L)是多杀菌素类的杀虫剂,具有生物农药的安全性和化学农药的速效性,主要降解方式是光解和微生物降解,最终分解为碳、氮、氧
QuEChERS前处理方法,操作简便,耗时短,溶剂少;UPLC-MS/MS检测方法线性关系良好,检出限和定量限均较低,具有较高的灵敏度和准确度,且串联质谱的选择反应监测(SRM)模式能较好地避免干扰,二者联合可满足定性和定量检测要求。QuEChERS/UPLC-MS/MS法的不足之处是需要使用较为贵重的超高效液相色谱-串联质谱仪,仪器操作相对复杂。
采用QuEChERS/UPLC-MS/MS法测定雷公藤及根际土壤中3种农药残留,在实际样品的检测结果中,土壤样品中3种农药残留均未检出,说明在雷公藤的种植过程中科学规范使用辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多杀菌素3种农药不会对雷公藤根际土壤造成残留污染。雷公藤根部样品中辛硫磷和乙基多杀菌素的残留量较低,均低于GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中对药用植物枸杞(干)规定的最大残留限量(2 mg/kg),同时也低于《美国药典-国家处方集》(USP40-NF35)、《欧盟药典》(EP 9.2)和《日本药典》(JP 17)中规定的2种农药的最大残留限量(0.01 mg/kg)。张治科
本研究建立的检测方法和实际样品检测结果,为制定3种农药在雷公藤及根际土壤中的残留限量标准提供了分析方法,对雷公藤种植过程中常用农药的风险监控具有一定的指导作用。但本研究只测定了乙基多杀菌素2种本体乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L的残留量,为更加严格控制残留,后续研究应增加2种代谢物N-脱甲基-乙基多杀菌素-J(N-demethyl-XDE-175-J)和N-甲酰基-乙基多杀菌素-J(N-formyl-XDE-175-J)的残留量检
参考文献References
LI X X,DU F Y,LIU H X,et al.Investigation of the active components in Tripterygium wilfordii leading to its acute hepatotoxicty and nephrotoxicity[J].Journal of ethnopharmacology,2015,162:238-243. [百度学术]
简应权,张金霞,王文章,等.雷公藤主要虫害综合防治技术[J].现代农业科技,2018(9):153-154.JIAN Y Q,ZHANG J X,WANG W Z,et al.Integrated control techniques of main pests of Tripterygium wilfordii[J].Modern agricultural science and technology,2018(9):153-154(in Chinese). [百度学术]
ELERSEK T, FILIPIC M. Organophosphorus pesicides-mechanisma of their toxicity[M]//STOYTCHEVA M. Pesticides:the impacts of pesticides exposure. Oxford, UK: Blackwell Pub Professional,2011: 243-268. [百度学术]
李增鑫,李亮,朱坤淼,等.华中地区稻纵卷叶螟对7种杀虫剂的敏感性监测[J].华中农业大学学报,2021,40(2):130-141.LI Z X,LI L,ZHU K M,et al.Susceptibility monitoring of Cnaphalocrocis medinalis Guenée to seven insecticides in central China[J].Journal of Huazhong Agricultural University, 2021,40(2): 130-141(in Chinese with English abstract). [百度学术]
姜波,彭楠,武迪,等.拟除虫菊酯类农药引起脑组织氧化应激反应的研究进展[J].毒理学杂志,2020,34(6):511-513.JIANG B,PENG N,WU D,et al.Research progress of pyrethroid pesticides induced oxidative stress in brain tissue[J].Journal of toxicology,2020,34(6):511-513(in Chinese). [百度学术]
王珂慧,郭超,刘艳丽,等.多杀菌素类杀虫剂的应用及其抗性研究进展[J].世界农药,2022,44(2):18-24.WANG K H,GUO C,LIU Y L,et al.Research progress on application and resistance of spinosyn insecticides[J].World pesticide,2022,44(2):18-24(in Chinese with English abstract). [百度学术]
任理雪,邓高琼,龙婉君,等.中药材中常见农药残留及其研究进展[J].中国中药杂志,2022,47(11):2899-2908.REN L X,DENG G Q,LONG W J,et al.Research progress on common pesticide residues in Chinese medicinal materials[J].China journal of Chinese materia medica,2022,47(11):2899-2908(in Chinese with English abstract). [百度学术]
王迪,俞佳,詹固,等.液质联用技术在中药研究中的应用进展[J].中华中医药学刊,2022,40(2):68-71.WANG D,YU J,ZHAN G,et al.Advances in application of liquid chromatography-mass spectrometry technology in study of traditional Chinese medicine[J].Chinese archives of traditional Chinese medicine,2022,40(2):68-71(in Chinese with English abstract). [百度学术]
ANASTASSIADES M,LEHOTAY S J,ŠTAJNBAHER D,et al.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce[J].Journal of aoac international,2019,86(2):412-431. [百度学术]
LEHOTAY S J,KOK A D,HIEMSTRA M,et al.Validation of a fast and easy method for the determination of residues from 229 pesticides in fruits and vegetables using gas and liquid chromatography and mass spectrometric detection[J].Journal of aoac international,2019,88(2):595-614. [百度学术]
PERESTRELO R,SILVA P,PORTO-FIGUEIRA P,et al.QuEChERS-fundamentals,relevant improvements,applications and future trends[J].Analytica chimica acta,2019,1070:1-28. [百度学术]
KOESUKWIWAT U,LEHOTAY S J,MASTOVSKA K,et al.Extension of the QuEChERS method for pesticide residues in cereals to flaxseeds,peanuts,and doughs[J].Journal of agricultural and food chemistry,2010,58(10):5950-5958. [百度学术]
MASTOVSKA K,DORWEILER K J,LEHOTAY S J,et al.Pesticide multiresidue analysis in cereal grains using modified QuEChERS method combined with automated direct sample introduction GC-TOFMS and UPLC-MS/MS techniques[J].Journal of agricultural and food chemistry,2010,58(10):5959-5972. [百度学术]
LIU Y Q,LI X Y,ZHOU C,et al.Toxicity of nine insecticides on four natural enemies of Spodoptera exigua[J/OL].Scientific reports,2016,6:390601[2022-09-16].https://doi.org/10.1038/s41598-022-20779-3. [百度学术]
张治科,李少南,张蓉,等.辛硫磷在宁夏甘草及对应根际土壤中的残留及消解动态[J].西北农业学报,2010,19(2):52-56.ZHANG Z K,LI S N,ZHANG R,et al.Residues and degradation dynamics of phoxim in Glycyrrhiza uralensis and rhizospheric soil in Ningxia[J].Acta agriculturae boreali-occidentalis sinica,2010,19(2):52-56(in Chinese with English abstract). [百度学术]
杨红兵,鲁立良,王自军.枸杞中拟除虫菊酯农药残留量的检测研究[J].时珍国医国药,2008,19(4):846-847.YANG H B,LU L L,WANG Z J.Studies on the determination of pyrethroids in Fructus lycii[J].Lishizhen medicine and materia medica research,2008,19(4):846-847(in Chinese with English abstract). [百度学术]
牛艳,杨静,冶海雄,等.枸杞中乙基多杀菌素及其代谢物的检测方法[J].农药,2019,58(11):828-830.NIU Y,YANG J,YE H X,et al.Detection method of spinetoram and its metabolites in Lycium fruit[J].Agrochemicals,2019,58(11):828-830(in Chinese with English abstract). [百度学术]