摘要
为建立雷公藤种植过程中常用农药的残留含量检测方法，采用快速样品前处理结合超高效液相色谱-串联质谱法（quick，easy， cheap，effective，rugged and safe/ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，QuEChERS/UPLC-MS/MS）测定雷公藤及根际土壤中辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多杀菌素的含量。样品中加入适量的水浸润后用乙腈超声提取，N-丙基乙二胺（PSA）吸附净化，利用优化后的UPLC-MS/MS方法进行检测，基质外标法定量。结果显示，3种农药在根样基质中的检出限（LOD）为0.001~0.714 μg/kg，定量限（LOQ）为0.002~2.380 μg/kg；在土壤基质中的检出限（LOD）为0.002~0.810 μg/kg，定量限（LOQ）为0.006~2.410 μg/kg。线性关系、回收率和相对标准偏差均符合农药残留检测的相关规定。结果表明，该方法能满足雷公藤及根际土壤中3种农药残留含量的快速检测要求。
雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）是卫矛科（Cleastraceae）雷公藤属植物，是我国传统的中药材之一，其主要活性成分为萜类和生物碱类化合物，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗菌、止痛等多种作
目前，常见的检测中药材中农药残留的方法主要包括色谱法、色谱-质谱联用技术、毛细管电泳法、免疫分析法和生物传感器技术等，其中色谱和质谱法在实际应用中比较广泛。中药材基质复杂，且待测农药大多数在高温下不稳定，所以液质联用技术成为了测定农药残留的主导技
QuEChERS法是在固相萃取基础上开发的一种新型样品前处理技
目前，针对我国雷公藤种植生产过程中常用的3种农药残留检测方法报道较少，且目前我国没有雷公藤药材中的农药残留标准。本研究通过快速样品前处理结合超高效液相色谱-串联质谱（QuEChERS/UPLC-MS/MS）法测定雷公藤及根际土壤中辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多杀菌素3种农药残留含量，并与相关国际标准进行对比，旨在为3种农药在雷公藤及根际土壤中的残留检测提供方法指导， 并为我国尽快制订雷公藤中药材中的农药残留标准提供一定的参考。
乙酸铵（色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色谱纯），中国武汉弗顿控股有限公司；乙腈和甲醇（质谱纯），美国Fisher公司；无水硫酸镁（MgSO4，分析纯），中国上海麦克林生化科技有限公司；氯化钠（NaCl，分析纯），德国BioFro公司；N-丙基乙二胺（PSA， 40~63 μm），美国Agela Technologies公司；乙基多杀菌素原药（100 mg，纯度为88.28%），德国Dr. Ehrensorfer公司；氯氰菊酯标准溶液（1 000 mg/L，丙酮中）和辛硫磷标准溶液（100 mg/L，丙酮中），坛墨质检科技股份有限公司。
雷公藤根样、土壤样品于2021年11月13日采集于湖北省阳新县平原村雷公藤种植基地 （115°E， 29°N）。随机取30株雷公藤作为检测植株样品，其中根样取自于所选定的雷公藤植株地下10~20 cm处，土样选择对应部位的根际土壤（黄棕壤，有机质17.88 g/kg，全氮0.46 g/kg，全磷0.86 g/kg，全钾6.29 g/kg，碱解氮84.35 mg/kg，速效磷25.92 mg/kg，pH 4.94）。
超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（TSQ Altis™），美国Thermo Fisher Scientific公司；色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美国Waters公司；FW80高速粉碎机、101-AB电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；BX3200H超声波清洗仪，上海新苗医疗器械制造有限公司；AR223CN分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；B-20R型冷冻离心机，德国NACHT公司；MX-S型旋涡混合器，美国Scilogex公司。
将雷公藤根样洗净，擦净表面水分后于65 ℃烘箱中烘干6 h，粉碎，过孔径230 μm筛，试验前于65 ℃烘箱中烘干4 h，备用。土壤样品自然风干，除去碎石、杂草和植物根茎等杂物，过孔径280 μm筛，备用。准确称取雷公藤根样和土壤样品各2 g（精确至0.01 g），分别置于50 mL 离心管中，各加入去离子水4 mL，充分浸润后，加入乙腈4 mL，涡旋混匀1 min，超声30 min后依次加入氯化钠0.4 g和无水硫酸镁1.6 g，再次涡旋2 min后4 000 r/min离心5 min。精密量取上清液2 mL于15 mL离心管中，分别加入N-丙基乙二胺0.1 g和无水硫酸镁0.3 g，旋涡1 min，于4 ℃、5 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm有机膜，待测。
乙基多杀菌素标准储备溶液：准确称取乙基多杀菌素标准品10 mg（精确至 0.1 mg）至10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解，定容至刻度，摇匀，配制成1 000 mg/L的标准储备溶液，在4 ℃冰箱中保存，待用。空白基质溶液：分别准确称取未施药的雷公藤根样和土壤样品各2 g（精确至0.01 g），按照本文“1.3”方法进行样品前处理，得到根样空白基质溶液和土壤空白基质溶液。空白基质标准工作溶液：用空白基质溶液分别稀释3种农药标准品溶液，配制一系列浓度的空白基质标准工作溶液，用于做基质匹配校准工作曲线。
色谱条件：色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；进样量1 μL；流速0.4 mL/min；流动相 A：乙腈；流动相B：5 mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱程序：0 min，5% A，95% B；10 min，99% A，1% B；13 min，99% A，1% B；13.1 min，5% A，95% B；15 min，5% A，95% B。
质谱条件：Thermo Fisher超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（TSQ Altis™）检测，电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；正离子扫描模式；选择反应监测模式（selective reaction monitoring，SRM）；毛细管电压3.5 kV；离子传输线温度325 ℃；雾化温度350 ℃；辅助气和鞘气均为N2，辅助气流速10 mL/min；鞘气流速40 mL/min。优化后的各目标化合物的质谱参数见
| 化合物 Compound | 分子式Molecular formula | 母离子/(m/z) Parent ion | 子离子/(m/z) Daughter ion | 碰撞能量/V Collision energy | 保留时间/min Retention time |
|---|---|---|---|---|---|
| 辛硫磷 Phoxim | C12H15N2O3PS | 299 |
271/12 | 18 | 9.1 |
| 氯氰菊酯 Cypermethrin | C22H19Cl2NO3 | 433.2 |
119/19 | 21 | 10.3 |
| 乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | C42H69NO10 | 748.5 |
203.1/142. | 23 | 10.8 |
| 乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | C43H69NO10 | 760.5 |
203.1/142. | 25 | 11.0 |
注： *定量离子。Note： * Quantitative ion.
考察了2种超高效液相色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和Waters ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）在乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-5 mmol/L的乙酸铵溶液2种流动相和梯度洗脱条件下分离目标物的情况。3种农药在不同的色谱柱和流动相条件下的保留时间、峰形和分离情况见
| 条件 Conditions | 保留时间/min Retention time | 峰形Peak shape | 分离度Resolution | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 辛硫磷Phoxim | 氯氰菊酯Cypermethrin | 乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | 乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | |||
| 1 | 9.1 | 9.1 | 9.0 | 9.6 | 较好 Better | 较好 Better |
| 2 | 10.3 | 10.6 | 10.2 | 10.7 | 差 Bad | 较好 Better |
| 3 | 10.8 | 10.8 | 10.8 | 10.6 | 较好 Better | 差 Bad |
| 4 | 11.0 | 11.0 | 11.0 | 11.0 | 差 Bad | 差 Bad |
注： 1：HSS T3 （1.8 μm）色谱柱和乙腈-5 mmol/L的乙酸铵溶液为流动相；2：HSS T3 （1.8 μm）色谱柱和乙腈-0.1%甲酸水为流动相；3：BEH C18 （1.7 μm）色谱柱和乙腈-5 mmol/L的乙酸铵溶液为流动相；4：BEH C18 （1.7 μm）色谱柱和乙腈-0.1%甲酸水为流动相。Note： 1： HSS T3 （1.8 μm） column and acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate solution as mobile phase； 2： HSS T3 （1.8 μm） column and acetonitrile-0.1% formic acid water as mobile phase； 3： BEH C18 （1.7 μm） column and acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate solution as mobile phase； 4： BEH C18 （1.7 μm） column and acetonitrile-0.1% formic acid water as mobile phase.
按照本文“1.4”方法配制一系列空白基质标准工作溶液，以浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），线性回归分析，拟合得各农药的基质匹配线性回归方程以及相关系数。如
化合物 Compound | 空白基质 Blank matrix | 线性方程 Linear equation | 相关系数 Correlation coefficient | 检出限/(μg/kg) LOD | 定量限/(μg/kg) LOQ |
|---|---|---|---|---|---|
| 辛硫磷 Phoxim | 根 Root | y = 9536.8x-1259.0 | 0.999 9 | 0.012 | 0.041 |
| 土壤 Soil | y = 9176.5x-2353.5 | 0.999 9 | 0.015 | 0.046 | |
| 氯氰菊酯 Cypermethrin | 根 Root | y = 442.21x-3871.8 | 0.999 2 | 0.714 | 2.380 |
| 土壤 Soil | y = 395.18x+1184.4 | 0.999 8 | 0.810 | 2.410 | |
| 乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | 根 Root | y = 98936x+172421 | 0.999 6 | 0.001 | 0.002 |
| 土壤 Soil | y = 115432x+69355 | 0.999 9 | 0.002 | 0.006 | |
| 乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | 根 Root | y = 29800x-9730.4 | 0.999 9 | 0.006 | 0.021 |
| 土壤 Soil | y = 25398x-1446.4 | 0.999 9 | 0.007 | 0.022 |
以信噪比（S/N）为10和3时对应的空白基质标准溶液的浓度为定量限（LOQ）和检出限（LOD），3种农药的定量限和检出限结果如
化合物 Compound | GB 2763—2021 （参考枸杞干Refer to dried Matrimony vine） | 中国药典（2020版）Chinese pharmacopoeia 2020 | 美国药典（40版）PharmacopeiaUSP 40 | 欧盟药典（9.2版）Europeanpharmacopeia 9.2 | 日本药典（2017版）Japanese pharmacopoeia 2017 | 韩国药典(10版)Koreanpharmacopeia 10 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 辛硫磷 Phoxim | - | - | 0.01 | 0.01 | 0.01 | - |
| 氯氰菊酯 Cypermethrin | 2 | - | 1 | 1 | 1 | 0.5 |
| 乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | 1 | - | 0.01 | 0.01 | 0.01 | - |
| 乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | 1 | - | 0.01 | 0.01 | 0.01 | - |
注： “-” 表示该农药在相应标准中无最大残留限量规定。Note：“-” indicates that there are no pesticide maximum residue limits in the corresponding standard.
3种农药在雷公藤根和土壤样中的回收率试验结果见
化合物 Compound | 添加水平/(μg/kg) Added levels | 平均回收率/% Average recovery | 相对标准偏差/% RSD | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 根 Root | 土壤 Soil | 根 Root | 土壤 Soil | ||
| 辛硫磷 Phoxim | 50 | 108.31 | 103.89 | 2.39 | 5.21 |
| 5 | 86.75 | 102.11 | 5.12 | 4.89 | |
| 1 | 88.36 | 113.08 | 5.67 | 3.98 | |
| 氯氰菊酯 Cypermethrin | 2 000 | 107.48 | 106.31 | 3.50 | 4.05 |
| 200 | 108.23 | 97.44 | 2.56 | 4.32 | |
| 5 | 105.78 | 96.69 | 3.86 | 3.28 | |
| 乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | 1 000 | 104.19 | 85.22 | 4.71 | 4.23 |
| 50 | 97.47 | 86.97 | 3.65 | 3.97 | |
| 1 | 106.34 | 97.05 | 4.34 | 5.55 | |
| 乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | 1 000 | 108.24 | 86.56 | 4.93 | 4.89 |
| 50 | 90.45 | 88.87 | 3.45 | 3.68 | |
| 1 | 107.17 | 98.09 | 5.02 | 5.38 | |
对采集于华润三九（黄石）药业有限公司雷公藤GAP种植示范基地（湖北省阳新县平原村）的雷公藤根部样品和土壤样品各30份进行检测，结果见
化合物 Compound | 根样 Root samples | 土壤样品 Soil samples |
|---|---|---|
| 辛硫磷 Phoxim | 0.010~0.037 | ND |
| 氯氰菊酯 Cypermethrin | 2.940~6.540 | ND |
| 乙基多杀菌素-J Spinetoram-J | <LOQ~0.005 | ND |
| 乙基多杀菌素-L Spinetoram-L | <LOQ~0.004 | ND |
注Note：ND表示未检出Not detected.
本研究检测的3种农药是雷公藤种植过程中最常用的农药，其中辛硫磷属于有机磷类农药，见光易分解、残留期短、残留危害小，适合施入土中，防止地下害虫。乙基多杀菌素（XDE-175-J， XDE-175-L）是多杀菌素类的杀虫剂，具有生物农药的安全性和化学农药的速效性，主要降解方式是光解和微生物降解，最终分解为碳、氮、氧
QuEChERS前处理方法，操作简便，耗时短，溶剂少；UPLC-MS/MS检测方法线性关系良好，检出限和定量限均较低，具有较高的灵敏度和准确度，且串联质谱的选择反应监测（SRM）模式能较好地避免干扰，二者联合可满足定性和定量检测要求。QuEChERS/UPLC-MS/MS法的不足之处是需要使用较为贵重的超高效液相色谱-串联质谱仪，仪器操作相对复杂。
采用QuEChERS/UPLC-MS/MS法测定雷公藤及根际土壤中3种农药残留，在实际样品的检测结果中，土壤样品中3种农药残留均未检出，说明在雷公藤的种植过程中科学规范使用辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多杀菌素3种农药不会对雷公藤根际土壤造成残留污染。雷公藤根部样品中辛硫磷和乙基多杀菌素的残留量较低，均低于GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中对药用植物枸杞（干）规定的最大残留限量（2 mg/kg），同时也低于《美国药典-国家处方集》（USP40-NF35）、《欧盟药典》（EP 9.2）和《日本药典》（JP 17）中规定的2种农药的最大残留限量（0.01 mg/kg）。张治科
本研究建立的检测方法和实际样品检测结果，为制定3种农药在雷公藤及根际土壤中的残留限量标准提供了分析方法，对雷公藤种植过程中常用农药的风险监控具有一定的指导作用。但本研究只测定了乙基多杀菌素2种本体乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L的残留量，为更加严格控制残留，后续研究应增加2种代谢物N-脱甲基-乙基多杀菌素-J（N-demethyl-XDE-175-J）和N-甲酰基-乙基多杀菌素-J（N-formyl-XDE-175-J）的残留量检
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