摘要
为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）的功能，克隆了HpGST基因的cDNA序列，并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST序列全长为666 bp，编码221个氨基酸，编码蛋白属于非分泌型不稳定亲水性蛋白，亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用；系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近，属谷胱甘肽转移酶Tau家族；实时荧光定量PCR分析结果显示，HpGST在火龙果不同色泽类型品种果肉中均有表达，在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型，表达趋势均为先上升后下降，其表达量与甜菜素含量呈现正相关，且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致，推测HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。
谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是一种普遍存在的参与多种细胞功能的蛋白，参与植物花青苷运输与定位。花青素的运输需要与GSH结合才能运输到液泡中，而谷胱甘肽泵能够识别与GSH结合标记的内源底物并将它们定位到合适部
火龙果（Hylocereus）为仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereusundatus）果树，因其富含甜菜素而具有很高的经济价值，被贵州省列为重点支持的特色产
选取贵州省罗甸县火龙果种植基地紫肉（紫红龙）、粉肉（粉红龙）、白肉（晶红龙）类型适龄植株挂牌标记，每种色泽类型品种选3株，采集开花后10、20、25、26、27、30 d果实，并分别标记为S1（10 DAF）、S2（20 DAF）、S3（25 DAF）、S4（26 DAF）、S5（27 DAF）、S6（30 DAF）。每个采样时期从3株植株各采1果，经清水洗净后液氮速冻，并置于-80 ℃超低温冰箱备用。
取约0.2 g样品经液氮速冻充分研磨后，采用多糖多酚植物RNA提取试剂盒（张家口赛诺生物科技有限公司），根据说明书操作步骤提取果实总RNA，利用全波长扫描酶标仪（Thermo Fisher）和1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和质量；利用TaKaRa公司反转录试剂盒（PrimeScrip
根据HpGST基因序列，使用Prism 5.0本地软件设计特异性引物（
| 引物名称 Primer name | 引物序列（5′-3′） Primer sequence（5′-3′） | 用途 Usage |
|---|---|---|
| HpGST-F | CGGAATCCAGAAACCCGTGTG |
HpGST基因cDNA扩增 Amplification of HpGST gene cDNA |
| HpGST-R | GCAACACTCAAGGCGTTAGCT | |
| qHpGST-F | TGCTGATTCACAACAACCGTCCG |
基因表达分析 Analysis of gene expression |
| qHpGST-R | TGCCTCCTGCTCTTCACCCT | |
| ACTION-2-F | TCCCGAAGAGCACCCAGTTT |
内参基因 Reference gene |
| ACTION-2-R | ATGGCATGAGGAAGGGCATA |
利用美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）进行核苷酸和氨基酸序列比对及保守结构域分析；使用MEGA 8.0 软件构建系统发育树；使用Expasy（https：//www.expasy.org/resources/protparam）在线分析软件预测蛋白质的理化性质和亲疏水性；TMHMM Server2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）在线软件分析蛋白质的跨膜结构域；使用Cell-PLoc 2（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）预测蛋白质的亚细胞定位，GOR4（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl）预测蛋白质二级结构。
将提取的火龙果总RNA反转录获得火龙cDNA，以火龙果cDNA为模板，利用引物HPGST-F和HPGST-R（
图 1 HpGST蛋白质二级结构预测分析
Fig. 1 Prediction analysis of secondary structure of HpGST protein
蓝色、紫色和红色分别代表α-螺旋、无规则卷曲和延伸链。Blue， purple and red stand for α -helix， irregular curls and extension chain， respectively.
使用NCBI的CDD在线分析软件对HpGST进行蛋白质保守结构域预测，结果（
图 2 火龙果HpGST保守结构域分析
Fig. 2 Conserved domain analysis of HpGST in pitaya
使用NCBI的BlastP在线分析软件进行在线比对，在蛋白质序列库中对HpGST进行同源性检索和比对分析。获取来自藜麦（Chenopodium quinoa）、甜菜亚种（Beta vulgaris subsp. vulgaris）、菠菜（Spinacia oleracea）、阿尔巴尼亚牧豆（Prosopis alba）等8种植物的15个蛋白氨基酸序列。利用MEGA7.0软件将HpGST蛋白与这15个GST蛋白序列进行多重序列比对并构建系统进化树（
图 3 HpGST与其他物种GST氨基酸序列系统进化树分析
Fig. 3 The phylogenetic tree analysis of GST amino acid sequences of HpGST and that of other species
使用DNAMAN8.0将HpGST的氨基酸序列与亲缘性较近的几个物种的GST氨基酸序列进行多重比对（
图 4 火龙果HpGST和其他植物GSTs蛋白序列比对
Fig. 4 Alignment of HpGST protein sequences of Hylocereus and GSTs protein sequences of other plants
不同颜色区域显示不同序列的一致性水平：氨基酸序列中深蓝色表示序列同源性为100%，粉色表示序列同源性为80%~90%，淡蓝色表示序列同源性为60%~70%，白色区域表示序列同源性<50%。Different color regions show different levels of identity： dark blue in amino acid sequences indicates 100% sequence homology， pink indicates 80%-90% sequence homology， light blue indicates 60%-70% sequence homology， and white regions indicate <50% sequence homology.
利用qRT-PCR分析HpGST在火龙果不同色泽类型品种、不同发育期果肉中的表达情况，表达结果（
图 5 火龙果果肉HpGST基因相对表达量
Fig. 5 Relative expression level of HpGST gene in Hylocereus
A.不同时期的表达量 Expression levels in different perios； B.不同色泽类型果肉中的表达量 Expression levels in different color types of flesh。同一时期不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同。Different lower-case letters in the same period indicate significant difference （P <0.05）.The ame as follows.
分析HpGST在火龙果不同发育期、不同色泽类型品种果肉中的表达情况，结果（
上述结果表明，HpGST基因在不同色泽类型品种果肉中均有表达，但表达特性不同。HpGST在有色素累积的果肉中表达量明显远高于无色素累积的白肉火龙果，且整体上呈现紫肉>粉肉>白肉，发育时期上呈现出随时间的延长而先上升后下降的趋势，其中在紫肉和粉肉类型的S5期（27 DAF）相对表达量最高，而白肉类型S4期（26 DAF）表达量最高。
甜菜红素在不同发育时期果肉中的含量变化结果（
图 6 不同色泽类型品种火龙果不同发育时期甜菜红素含量变化
Fig. 6 Variation of betacyanin content in different Hylocereus cultivars at different development stages
A：不同时期甜菜红素含量 Betacyanin content at different periods； B：不同色泽类型果肉甜菜红素含量 Betacyanin content in different color types of flesh.
甜菜红素在不同色泽类型品种火龙果果肉中的含量变化（
甜菜黄素在火龙果不同发育时期果肉中的含量变化（
图 7 不同色泽类型品种火龙果不同发育时期甜菜黄素含量变化
Fig.7 Variation of betaxanthin content in different varieties of Hylocereus at different development stages
A：不同时期甜菜黄素含量 Betaxanthin content at different periods； B：不同色泽类型果肉甜菜黄素含量 Betaxanthin content in different color types of flesh.
甜菜黄素在不同色泽类型品种火龙果果肉中的含量变化结果（
比较HpGST基因在火龙果中的表达与甜菜素的含量变化，发现在火龙果发育时期，HpGST基因的表达与色素累积呈现相同趋势（不同发育时期基因表达量和色素含量趋势相同，且在不同色泽类型品种表达量和甜菜素含量也呈现出显著的同一性），而成熟期甜菜素累积到一定程度会抑制HpGST基因的表达。对比不同色泽类型品种火龙果中HpGST基因的表达与甜菜素的含量变化发现，在S1-S2期HpGST基因表达量及甜菜素含量都极低，且都是从S3期开始，不同色泽类型品种间基因表达量及甜菜素含量都呈现出紫肉>粉肉>白肉的趋势。即HpGST基因表达与甜菜素含量变化具有高度统一的时空性。
甜菜素作为一种重要的天然色素，应用前景广阔，消费市场潜力巨大，然而有关甜菜素的研究多集中在合成通路上，而对于甜菜素合成后运输与定位的研究却鲜有报道。
谷胱甘肽-S转移酶（GSTs）在植物中具有对花青素的运输标记功能，因GST具有特殊的亲和性，能将花青苷和谷胱甘肽形成偶联连
本研究对比火龙果中谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）编码蛋白定位部位和蛋白类型都与花青素来源植物中的GSTs编码蛋白相似，对HpGST在火龙果中的表达与甜菜素含量进行相关性分析发现，火龙果中甜菜素（包括甜菜红素和甜菜黄素）含量的变化随发育时期的延长而不断增加，并且与HpGST基因表达量具有相同趋势。且甜菜素（包括甜菜红素和甜菜黄素）含量在不同色泽类型品种火龙果中的含量与HpGST基因的表达量表现出高度一致的趋势即紫肉>粉肉>白肉。推测HpGST基因与火龙果果肉中甜菜素的累积和分布有着紧密联系。
本研究通过对比不同色泽类型品种、不同发育时期火龙果中HpGST基因的表达和甜菜素的含量变化，对参与色素运输的谷胱甘肽S-转移酶基因（GST）在火龙果中的作用进行了初步研究。鉴于GST在花青苷运输与定位的重要作用，推测HpGST基因对火龙果中甜菜素的运输、积累和储存起到重要调控作用，其具体的分子作用机制还需进一步探究，为火龙果果实中甜菜素累积与运输的深入研究提供一个新的视角，进而为解析甜菜素的合成代谢调控提供科学根据。
参考文献
SANDERMANN H.Higher plant metabolism of xenobiotics： the “green liver” concept［J］.Pharmacogenetics，1994，4（5）： 225-241. [百度学术]
樊连梅， 刘更森， 李思琪， 等.苹果谷胱甘肽S-转移酶基因MdGSTF3的克隆及其表达分析［J］.植物生理学报，2015，51（9）：1502-1512.FAN L M，LIU G S，LI S Q，et al.Cloning and expression analysis of apple glutathione S-transferase gene MdGSTF3［J］.Journal of plant physiology，2015，51（9）：1502-1512（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
刘海峰，王军.山葡萄谷胱甘肽S-转移酶基因（VAmGST4）克隆及表达分析［J］.植物生理学报，2011，47（12）：1161-1166.LIU H F， WANG J.Cloning and expression analysis of glutathione S-transferase gene （VmGST4） in Grape ［J］.Chinese journal of plant physiology，2011，47（12）：1161-1166（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
CAMILA G，GENEVIÈVE C，LAURENT T，et al.In vivo grapevine anthocyanin transport involves vesicle-mediated trafficking and the contribution of anthoMATE transporters and GST［J］.The plant journal：for cell and molecular biology，2011，67（6）： 960-970. [百度学术]
MARIA F R，ANA R，AGNÈS A，et al.ABCC1，an ATP binding cassette protein from grape berry，transports anthocyanidin 3-O-glucosides［J］.The plant cell，2013，25（5）： 1840-1854 [百度学术]
杨仕美，乔光，文晓鹏.火龙果EST-SSR分子标记反应体系的建立与优化［J］.山地农业生物学报，2018，37（3）：14-20.YANG S M，QIAO G，WEN X P.Establishment and optimization of EST-SSR molecular marker reaction system in pitaya［J］.Journal of mountain agricultural biology，2018，37（3）：14-20（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
于思礼，刘雪，张昭宇，等.甜菜素的生物合成及其代谢调控进展［J］.中国生物工程杂志，2018，38（8）：84-91.YU S L，LIU X，ZHANG Z Y，et al.Biosynthesis and metabolic regulation of beet ［J］.Chinese journal of bioengineering，2018，38（8）：84-91 （in Chinese with English abstract）. [百度学术]
吴亚维，徐娟，韩秀梅，等.红白果肉颜色火龙果果肉转录组分析和基因功能注释［J］.分子植物育种，2019，17（2）：400-410.WU Y W，XU J，HAN X M，et al.Transcriptome analysis and gene function annotation of pitaya fruit with red and white flesh ［J］.Molecular plant breeding，2019，17（2）：400-410 （in Chinese with English abstract）. [百度学术]
曾灿彬.红肉与白肉火龙果果实发育的色素比较与差异表达基因研究［D］.海口：海南大学，2017：11.ZENG C B.Study on pigment comparison and differentially expressed genes between red and white pitaya fruit ［D］.Haikou： Hainan University，2017：11（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
ALFENITO M R，SOUER E，GOODMAN C D，et al.Functional complementation of anthocyanin sequestration in the vacuole by widely divergent glutathione S-transferases［J］.The plant cell，1998，10（7）：1135-1149. [百度学术]
HUAIBI Z，LEI W，SIMON D，et al.New insight into the structures and formation of anthocyanic vacuolar inclusions in flower petals［J/OL］.BMC plant biology，2006，6（1）：29［2022-07-28］.https：//doi.org/10.1186/1471-2229-6-29. [百度学术]
DANIELA B，LUISA T，FRANCESCA D G，et al.Antioxidant activities of sicilian prickly pear （Opuntia ficus indica） fruit extracts and reducing properties of its betalains： betanin and indicaxanthin［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2002，50（23）： 6895-6901. [百度学术]
ALFONSO T，TAO F，HESTER S，et al.The evolution of betalain biosynthesis in Caryophyllales［J］.The new phytologist，2019，224（1）： 71-85. [百度学术]
王长泉，刘涛，王宝山.植物甜菜素研究进展［J］.植物学通报，2006，23（3）：302-311.WANG C Q，LIU T，WANG B S.Advances in research on plant beets ［J］.Chinese journal of botany，2006，，23 （3）：302-311（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
KHAN M I.Stabilization of betalains： a review［J］.Food chemistry，2016，197：1280-1285. [百度学术]
CHEN N，YU Z H ，XIAO X G.Cytosolic and nuclear co-localization of betalain biosynthetic enzymes in tobacco suggests that betalains are synthesized in the cytoplasm and/or nucleus of betalainic plant cells［J/OL］.Frontiers in plant science，2017，8：831［2022-07-28］.https：//doi.org/10.3389/fpls.2017.00831. [百度学术]