摘要
为探明广东省韶关市某大口黑鲈（Micropterus salmoides）养殖场的大口黑鲈幼鱼大量死亡的原因，对患病鱼进行临床观察，并从细菌学、寄生虫学、病毒学三方面进行检测，排除细菌和寄生虫感染的可能性后，通过RT-PCR检测、细胞分离培养、人工感染、组织病理切片苏木精-伊红（H&E）染色、超薄切片透射电镜观察、系统发育树分析，初步确定分离得到1株大口黑鲈弹状病毒（micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV），命名为大口黑鲈弹状病毒韶关株（MSRV-SG01）。人工感染试验结果显示，试验鱼2 d内出现死亡，并伴随出血、烂尾、拖便等临床症状，7 d内死亡率达100%，通过组织病理学切片观察到病鱼的肝脏、脾脏均呈现大面积坏死，与自然患病鱼症状相符。根据G蛋白氨基酸序列，将分离到的MSRV-SG01毒株与GenBank中已报道的其他的弹状病毒进行系统发育树分析比对，结果显示， MSRV-SG01毒株与MSRV-FJ985、MSRV-YH01、SCRV聚为一类，且与已报道的MSRV-FJ985毒株、MSRV-YH01毒株同源性高达97%以上。通过以上的试验分析，确定幼鱼大量死亡的原因为MSRV感染。
大口黑鲈（Micropterus salmoides），又名加州鲈，是北美洲重要的游钓性鱼类，于1983年被引进中国广
2021年广东省韶关市某大口黑鲈养殖场出现大口黑鲈幼鱼大量死亡的现象。患病的大口黑鲈主要表现为体色发白、身体失衡、螺旋打转、聚游水面。为了弄清病因，本研究对患病大口黑鲈进行临床观察，从细菌学、寄生虫学、病毒学三方面进行了检测，并通过分子生物学分析、透射电镜观察等方法，鉴定其病原为大口黑鲈弹状病毒，命名为大口黑鲈弹状病毒韶关株 （MSRV-SG01）。现报道如下。
病鱼来源于广东韶关某大口黑鲈养殖场。试验用鱼购自广东佛山某大口黑鲈鱼种繁育场，鱼体质量为（0.5±0.1） g，体长为（3±0.5） cm。试验开始前，随机抽取3尾鱼进行 RT-PCR 检测，确定无病毒携带后，暂养2周，每天早晚各投喂1次，利用加热棒将水温控制在26 ℃左右，使用增氧装置将溶氧控制在5 mg/L左右。
鲤上皮瘤细胞（epithelioma papillosum cyprini cells， EPC）、胖头鱥肌肉细胞（fathead minnow muscle cells， FHM）、斑点叉尾鮰卵巢细胞系（channel catfish ovary cells， CCO）细胞来源于笔者所在实验室细胞库；石斑鱼脾脏细胞（grouper spleen cells， GS）由华南农业大学秦启伟教授惠赠；总DNA提取试剂盒、Trizol和凝胶小量DNA胶回收试剂盒购自Magen；反转录试剂盒购自ABclonal；M199细胞培养基购自Cytiva；胎牛血清、0.25% EDTANa2的胰酶购自Hyclone；PBS缓冲液购自Bio-Channel；2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR Mix、DNA Marker、核酸染料和琼脂糖购于北京百奥莱博科技有限公司。
取病鱼体表黏液制备涂片和压片，在光学显微镜下观察有无寄生虫感染。随机取3尾病鱼用酒精棉擦拭鱼体后，在无菌条件下整尾鱼匀浆，PBS稀释后 1 000 r/min离心2 min去沉淀，LB平板上划线培养24 h后，观察菌落的生长状况。
随机取4尾病鱼用酒精棉球擦拭鱼体后，在无菌条件下整尾鱼匀浆，加入300 μL无菌PBS缓冲液稀释后平均分成3份，1份冻存于-80 ℃用于后续病毒的分离鉴定，另外2份用于鱼类病毒检测。将2份中的1份置于Trizol中提取总RNA，另1份用DNA试剂盒提取DNA，采用特异性引物进行PCR检测（引物信息见
| 引物名称Prime name | 序列（5′-3′） Sequence（5′-3′） | 用途 Purpose |
|---|---|---|
| MSRV-F1 | AGGTGTCCCAGTTATGC | 检测MSRV |
| MSRV-R1 | TTGCCTGTTGACATTCTA | Detect MSRV |
| ISKNV-F | GCATGTATGCTGTTTAGACA | 检测ISKNV |
| ISKNV-R | AGCATCAAGCAGGCGATCTG | Detect ISKNV |
| LMBV-F | GGGCAGACCTCAAGAACCAAT | 检测LMBV |
| LMBV-R | CTTTTTCGGCTGTCCAACAAA | Detect LMBV |
| NNV-F | CGTGTCAGTCATGTGTCGCT | 检测NNV |
| NNV-R | CGAGTCAACACGGGTGAAG | Detect NNV |
| MSRV-F | ATGAAAAAAACTTTAACAGATTTCA | 扩增MSRV-G基因 |
| MSRV-R | GGGAACAAATTGATACTGCTGC | Amplification of MSRV-G gene |
| 16S-27F | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | 检测细菌 |
| 16S-1492R | ACGGCTACCTTGTTACGACTT | Detect bacteria |
从-80 ℃冰箱取出病料匀浆液，无菌条件下取20 μL，用无菌PBS缓冲液将匀浆液稀释10倍，然后取20 μL稀释后的匀浆液加到5 mL无血清M199培养液中，存于-80 ℃冰箱反复冻融3次，充分裂解释放病毒。4 ℃条件下将冻融后的匀浆液1 000 r/min离心10 min去除组织碎片，再经0.22 μm微孔过滤器除菌后，分别接种于已长满单层的EPC、FHM、CCO、GS细胞，28 ℃孵育吸附1 h后更换成相应的细胞维持培养基，并设置未接毒阴性对照，每天观察细胞病理变化，并拍照记录。待90%的细胞出现细胞病变时，收集上清及细胞，反复冻融3次，1 000 r/min离心10 min，然后将病毒悬液继续接种细胞，传代3次。
以无血清M199培养基10倍梯度稀释病毒（1
取1瓶单层细胞密度90%的EPC细胞，于无菌环境下加入5 mL的病毒悬液，28 ℃吸附1 h，然后更换含5% FBS的M199维持培养基，28 ℃培养15 h后吸弃维持液，将细胞用无菌PBS洗涤1次，弃之，再加入1 mL胰酶消化30 s，用枪头把细胞吹下来，转移至2 mL无菌EP管中，1 000 r/min离心3 min（细胞团绿豆大小）。弃上清，缓慢加入1 mL常温戊二醛（2.5%），将细胞团轻轻挑起，悬浮于固定液中，先室温避光固定30 min，再转移到4 ℃冰箱保存，交于武汉赛维尔生物科技有限公司进行包埋、制片、拍照。
将试验鱼随机分为A、B、C 3组，每组30尾鱼。A、B组分别腹腔注射10 μL的1
分别取攻毒鱼的肝、脾、肠组织，4%多聚甲醛固定24 h，各组织分别经70%、80%、95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明、石蜡包埋切片 （5~7 µm）、H&E染色，最后在显微镜下观察、拍照。
采用设计的覆盖MSRV-G基因全长序列的保守性引物对MSRV-F/MSRV-R进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收送至武汉擎科有限公司测序，在NCBI将测序结果进行Blast分析。在GenBank中下载常见的几种弹状病毒G蛋白氨基酸序列，利用MEGA7.0软件绘制该毒株与大口黑鲈弹状病毒（MSRV-FJ985； GenBank： MT818233.1、MSRV-YH01； GenBank：mk397811.2）、鳜弹状病毒（Sinipercachuatsi rhabdovirus， SCRV； GenBank： NC_008514.1）、水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis Indiana virus， VSV； GenBank： MW373779）、梭子鱼苗弹状病毒（pike fry rhabdovirus， PFRV； GenBank： NC_025356.1）、鲤春病毒血症病毒（spring viremia of carp virus， SVCV； GenBank： AJ318079.1）、牙鲆弹状病毒（hirame rhabdovirus， HIRRV； GenBank： AF104985.2）、传染性造血器官坏死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus， IHNV； GenBank： X89213.1）、乌鳢弹状病毒 （snakehead rhabdovirus， SHRV； GenBank： NC_000903.1）、病毒性出血性败血症病毒（viral hemorrhagic septicemia， VHSV； GenBank： KP866927.1）的系统发育树。
自然发病鱼池的水温为26 ℃，病鱼全长0.8~1.0 cm，发病前期在水面聚集、停止摄食，发病后期身体失衡、螺旋打转、并出现死亡。健康大口黑鲈幼鱼背部为青灰色、腹部灰白色（
图1 患病鱼的临床症状
Fig. 1 Clinical symptoms of diseased fish
A：健康大口黑鲈，箭头指示为卵黄囊；B：发病大口黑鲈，箭头指示为卵黄囊。 A： Healthy Micropterus salmoides， arrows indicate yolk sac； B： Diseased Micropterus salmoides， arrows indicate yolk sac.
取组织匀浆液划线分离未见致病菌，体表黏液在显微镜下未观察到寄生虫。通过几种特异性检测引物对MSRV-F1/MSRV-R1、ISKNV-F/ISKNV-R、LMBV-F/LMBV-R、NNV-F/NNV-R对病料进行PCR检测，结果如
图2 不同鱼类病毒的RT-PCR检测的结果
Fig. 2 Results of RT-PCR detection of different fish viruses
M：DL 2000 marker；1、3、5、7： MSRV、ISKNV、LMBV、NNV的样品结果；2、4、6、8： MSRV、ISKNV、LMBV、NNV阴性对照。 M： DL2000 marker； 1，3，5，7： Sample results for MSRV， ISKNV， LMBV， NNV； 2，4，6，8： Negative control of MSRV， ISKNV， LMBV， NNV.
将无菌处理后的病料悬液分别接种EPC、FHM、CCO、GS细胞，24 h后进行拍照观察。结果显示EPC、FHM、CCO均出现不同程度的病变（箭头指示），主要表现为细胞皱缩、聚团，病变严重部位大面积死亡并脱落，阴性对照组细胞表现正常。MSRV对这3种细胞的敏感度从高到低依次为：EPC>FHM>CCO，而接毒后的GS细胞与阴性对照组相比无明显差异，表明MSRV对该细胞不敏感（
图3 病料接种不同细胞系24 h后的病变结果（40×）
Fig. 3 Lesion results after 24 hours of inoculation with different cell lines （40×）
病毒在EPC细胞上最敏感，后续将病毒在EPC细胞上盲传3代，收取接毒24 h的上清进行病毒效价测定，空斑测定结果显示，病毒效价为1
图4 病毒在EPC细胞中的生长动力学曲线
Fig. 4 Growth kinetics of virus in EPC cells
用2.5%戊二醛固定接毒15 h的EPC细胞，然后在HITACHI HT7700透射电镜下观察，发现大量具有子弹状特征的病毒粒子，病毒纵切面呈现圆形或椭圆形，长度为120~170 nm，直径为50~65 nm（
图5 透射电镜下观察病变细胞中的病毒粒子的形态大小
Fig. 5 Observation of the shape and size of virus particles in diseased cells under a transmission electron microscope
攻毒试验结果显示，A组、B组大口黑鲈均于接毒后的第2天开始死亡。攻毒后第3天，观察到攻毒组大部分试验鱼游动缓慢、浮游池边，有个体出现身体失衡、打转、身体弯曲的现象。肉眼观察，对照组（C组）试验鱼体表完整，健康有光泽（
图6 人工感染后大口黑鲈的临床症状
Fig. 6 Clinical symptoms of Micropterus salmoides after artificial infection
A：健康大口黑鲈；B、C、D：人工感染发病大口黑鲈。A： Healthy Micropterus salmoides； B， C， D： Micropterus salmoides with artificial infection.
图7 攻毒模型生存曲线
Fig. 7 The survival curve of the challenge model
H&E染色结果显示，与对照组（
图8 MSRV感染大口黑鲈的组织病理变化
Fig. 8 Histopathological changes of MSRV-infected Micropterus salmoides
A：对照组肝脏；B：攻毒组肝脏；C：对照组脾脏；D：攻毒组脾脏；E：对照组肠；F：攻毒组肠。A： Liver of control group； B： Liver of challenge group； C： Spleen of control group； D： Spleen of challenge group； E： Intestine of control group； F： Intestine of challenge group.
以接种病毒悬液24 h的EPC细胞为样品，经RNA提取、反转录后得到模板cDNA，采用特异性引物MSRV-F/MSRV-R扩增G基因全长序列，得到1条与预期结果一致的大约位于1 500 bp的特异性条带，测序结果显示，G基因ORF为1 541 bp。通过Blast比对MSRV-SG01与其他弹状病毒的同源性，发现MSRV-SG01与MSRV-FJ985、MSRV-YH01这2株大口黑鲈弹状病毒的核苷酸同源性分别为99.36%、98.19%，氨基酸同源性分别为99%、97%。利用MEGA7.0聚类分析MSRV-SG01 G蛋白氨基酸序列与MSRV-FJ985、MSRV-YH01、SCRV、VSV、PFRV、SVCV、HIRRV、IHNV、SHRV、VHSV的G蛋白氨基酸序列，结果显示MSRV-SG01毒株与MSRV-FJ985、MSRV-YH01、SCRV聚为同一分支，并与MSRV-FJ985毒株的亲缘关系最近，但与诺拉弹状病毒属的VHSV亲缘关系较远（
图9 MSRV-SG01 G蛋白氨基酸序列系统发育树
Fig. 9 Phylogenetic tree of MSRV-SG01 G protein amino acid sequence
弹状病毒（rhabdovirus）是单股负链RNA病毒，基因组大小为10.08~16.1 k
根据以往的研究报道，自然感染MSRV的大口黑鲈体长为2.5~4.5 c
本研究发现MSRV-SG01毒株对EPC、FHM、CCO均敏感，都可以产生明显细胞病变现象，该毒株能在不同科的鱼类细胞中复制，说明其具有较强的感染
为进一步确定MSRV-SG01毒株的分类地位，本研究在GenBank中下载了MSRV-FJ985、MSRV-YH01、SCRV、VSV、PFRV、SVCV、HIRRV、IHNV、SHRV、VHSV这几种常见弹状病毒的G蛋白氨基酸序列。根据系统发育树结果， 本试验分离得到的MSRV-SG01毒株与MSRV-FJ985、MSRV-YH01、SCRV聚为一类，且与已报道的MSRV-FJ985毒株、MSRV-YH01毒株的核苷酸同源性分别高达99.36%、98.19%，氨基酸同源性分别高达99%、97%，同源性较高，但仍具有一定差异，这可能是MSRV-SG01毒株在本研究建立的攻毒模型中导致较高死亡率的原因之一。
综上，本研究从携带卵黄囊的大口黑鲈幼鱼上分离出1株MSRV-SG01毒株，可为MSRV的垂直传播提供参考依据，建议从源头防控水生动物疾病，以促进大口黑鲈的健康养殖。
参考文献 References
BAI J J，LUTZ-CARRILLO D J，QUAN Y C，et al.Taxonomic status and genetic diversity of cultured largemouth bass Micropterus salmoides in China［J］.Aquaculture，2008，278（1/2/3/4）：27-30. [百度学术]
张韵桐.大口黑鲈的生物学特征［J］.中国水产，1993（2）：28-29.ZHANG Y T. Biological characteristics of largemouth bass［J］.China fisheries，1993（2）：28-29（in Chinese）. [百度学术]
CAI J，YU D P，XIA H L，et al.Identification and characterization of a nervous necrosis virus isolated from largemouth bass （Micropterus salmoides）［J］.Journal of fish diseases，2022，45（4）：607-611. [百度学术]
HO P Y，CHEN Y C，MAEKAWA S，et al.Efficacy of recombinant protein vaccines for protection against Nocardia seriolae infection in the largemouth bass Micropterus salmoides［J］.Fish & shellfish immunology，2018，78：35-41. [百度学术]
张晗，邓捷，马红英，等.大口黑鲈相关疾病及防治技术研究进展［J］.河北渔业，2022（2）：38-44.ZHANG H，DENG J，MA H Y，et al.Research progress on related diseases and control techniques of largemouth bass［J］.Hebei fisheries，2022（2）：38-44（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
冯东岳，温周瑞.鱼类病毒病的研究进展及其展望［J］.养殖与饲料，2011（6）：18-21.FENG D Y，WEN Z R.Research progress and prospect of fish virus diseases［J］.Animals breeding and feed，2011（6）：18-21（in Chinese）. [百度学术]
MA D M，DENG G C，BAI J J，et al.A strain of Siniperca chuatsi rhabdovirus causes high mortality among cultured largemouth bass in South China［J］.Journal of aquatic animal health，2013，25（3）：197-204. [百度学术]
雷燕，戚瑞荣，崔龙波，等.大口黑鲈鱼种弹状病毒病的诊断［J］.大连海洋大学学报，2015，30（3）：305-308.LEI Y，QI R R，CUI L B，et al.Diagnosis of rhabdovirus disease in juvenile largemouth bass Micropterus salmoides［J］.Journal of Dalian Ocean University，2015，30（3）：305-308（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
WALKER P J，FIRTH C，WIDEN S G，et al.Evolution of genome size and complexity in the Rhabdoviridae［J/OL］.PLoS pathogens，2015，11（2）：e1004664 ［2022-05-14］.https：//doi.org/10.1371/journal.ppat.1004664 . [百度学术]
AL-HUSSINEE L，LORD S，STEVENSON R M W，et al.Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb［J］.Diseases of aquatic organisms，2011，93（2）：117-127. [百度学术]
LYU S J，YUAN X M，ZHANG H Q，et al.Isolation and characterization of a novel strain （YH01） of Micropterus salmoides rhabdovirus and expression of its glycoprotein by the baculovirus expression system［J］.Journal of Zhejiang University：science B，2019，20（9）：728-739. [百度学术]
GAO E B，CHEN G F.Micropterus salmoides rhabdovirus （MSRV） infection induced apoptosis and activated interferon signaling pathway in largemouth bass skin cells［J］.Fish & shellfish immunology，2018，76：161-166. [百度学术]
刘慧芳，张莉娟，李宁求，等.加州鲈弹状病毒三水株全基因组序列测定及分析［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2020，48（3）：30-38.LIU H F，ZHANG L J，LI N Q，et al.Genome sequencing and analysis of Sanshui strain of Micropterus salmoides rhabdovirus［J］.Journal of Northwest A ＆ F University （natural science edition），2020，48（3）：30-38（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
BANDÍN I，SOUTO S.Betanodavirus and VER disease：a 30-year research review［J/OL］.Pathogens （Basel，Switzerland），2020，9（2）：106 ［2022-05-14］.https：//doi.org/10.3390/pathogens9020106. [百度学术]
FU X Z，LIN Q，LIANG H R，et al.The biological features and genetic diversity of novel fish rhabdovirus isolates in China［J］.Archives of virology，2017，162（9）：2829-2834. [百度学术]
TAO J J，GUI J F，ZHANG Q Y.Isolation and characterization of a rhabdovirus from co-infection of two viruses in mandarin fish［J］.Aquaculture，2007，262（1）：1-9. [百度学术]
WATTANAVIJARN W， WATTANODORN S， HUNNAK P， et al. Viruses of ulcerative diseased fish ［J］. Electron Microsc Soc Thailand Newsl， 1986， 3： 20-23. [百度学术]
YANG F，SONG K G，ZHANG Z Y，et al.Evaluation on the antiviral activity of ribavirin against Micropterus salmoides rhabdovirus （MSRV） in vitro and in vivo［J/OL］.Aquaculture，2021，543：736975 ［2022-05-14］. https：//doi.org/10.1016/j.aquaculture.2021.736975. [百度学术]
HU Y，SHAN L P，QIU T X，et al.Synthesis and biological evaluation of novel coumarin derivatives in rhabdoviral clearance［J/OL］.European journal of medicinal chemistry，2021，223：113739 ［2022-05-14］. https：//doi.org/10.1016/j.ejmech.2021.113739. [百度学术]