摘要
为探究团头鲂细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）家族基因的序列特征和功能，从NCBI数据库获取socs1、socs2、socs3a、socs3b、socs4、socs5a、socs5b、socs6、socs7、socs9共10个socs基因的cDNA序列，利用ExPASy、SMART等在线网站对其进行生物信息学分析，预测团头鲂10个SOCS的理论分子质量、理论等电点与结构域等分子特性。系统进化（MEGA 6软件）分析结果显示，10个SOCS可分为2个亚族：Ⅰ型亚族包括SOCS4、SOCS5a、SOCS5b、SOCS6、SOCS7与SOCS9，Ⅱ型亚族包括SOCS1、SOCS2、SOCS3a与SOCS3b。半定量PCR结果显示，健康团头鲂10个socs基因在被检测组织中具有明显的组织特异性，socs1、socs2、socs3在多个组织中表达量较高。在嗜水气单胞菌感染后，采用实时定量PCR检测团头鲂socs基因在脾脏、体肾、头肾中的表达量，其中socs1、socs2、socs3a、socs3b表达量均显著上调。结果表明，团头鲂SOCS家族基因的表达模式各不相同，预示其功能的多样性，其中socs1、socs2、socs3在免疫应答中发挥重要作用。
细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）家族成员是重要的细胞因子受体信号反馈抑制因
目前，在哺乳动物中对SOCS家族基因功能已有深入研究，已有大量研究探究了SOCS家族基因的主要功
团头鲂（Megalobrama amblycephala）属鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）、鲌亚科（Culterinae）、鲂属（Megalobrama），因其具有肉质较嫩、个体规格适于中国家庭消费、生长速度较快、易于养殖且养殖成本不高等优点而备受广大养殖户的青睐。但是近年来，不合理的养殖结构和布局及滥用药物等，严重阻碍了其养殖业的持续健康发展。其中由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）引发的细菌性败血症每年都会导致大量的团头鲂死亡，造成巨大经济损失。团头鲂抗嗜水气单胞菌感染的相关基因的研究已有很
试验所用团头鲂均采集于湖北省洪湖市洪湖水产鱼种养殖场，幼鱼体质量为（50±10） g，成鱼体质量为（500±20） g。将试验鱼转移到华中农业大学水产学院实验基地中暂养，水温为25~28 ℃，24 h不间断充氧，早晚各换水1次，换水量为总体积的1/4，暂养14 d后开始试验。
首先检索NCBI数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）获得团头鲂socs1、socs3a、socs3b基因（GenBank登录号：MK101316.1，MH107241.1，MH107242.1）与斑马鱼（Danio rerio）socs2、socs4、socs5a、socs5b、socs6、socs7、socs9基因（登录号：NM_001114550.1，NM_001111225.1，NM_001113758.2，NM_001113797.1，EF195764.1，NM_001287077.1，NM_001113801.1）的cDNA序列，并利用斑马鱼socs基因的cDNA序列通过本地Blast从团头鲂转录组（登录号：PRJNA716731）中获取对应的团头鲂序列。
通过ORF Finder（www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）预测10个团头鲂socs基因的ORF及氨基酸序列；利用ExPASy（http：//web.expasy.org/compute_pi/）预测其蛋白质的理论分子质量（MWs）与理论等电点（pI）；使用SMART（http：//smart.embl.de/）预测其蛋白质结构域，并使用IBS 1.0.3进行绘图；从GenBank数据库获取斑马鱼、青鳉（Oryzias latipes）、小鼠（Mus musculus）和人（Homo sapiens）等脊椎动物物种已有的SOCS蛋白序列，利用MEGA 6使用邻接法（Neighbour-Joining，NJ法）构建进化树。
为了确定团头鲂socs基因的组织表达模式，分别取3尾健康团头鲂成鱼的心脏、肝脏、脾脏、体肾、头肾、脑、血液、肠道、肌肉和鳃10个组织（器官）。
为了探究嗜水气单胞菌感染后团头鲂socs基因的组织表达模式，以团头鲂幼鱼为试验对象，随机设置对照组与感染组2个处理组，每一处理设置3个生物学重复（每个生物学重复取3尾鱼）。感染试验中，对感染组团头鲂每尾腹腔注射0.1 mL浓度为6.7×1
上述样品快速分离后置于液氮中，冻存24 h后转入-80 ℃冰箱中保存备用。
组织总RNA提取采用Trizol法，具体步骤参照Trizol试剂（Invitrogen）说明书。提取的RNA浓度通过紫外分光光度计（Nanodrop 2000，美国）进行测定，RNA的完整度与纯度通过琼脂糖凝胶电泳法测定。使用PrimeScript™ RT reagent Kit（TaKaRa，日本）试剂盒按照说明书对提取的RNA进行反转录，将获得的cDNA保存于-20 ℃冰箱。
通过半定量PCR方法检测socs基因在健康团头鲂不同组织的表达量。PCR反应体系为10.0 μL，包括cDNA模板1.0 μL、ddH2O 7.1 μL、10×Taq PCR Buffer 1.0 μL、上下游引物各0.3 μL、dNTP 0.15 μL、Taq DNA酶0.15 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min后，94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。扩增后，取5.5 μL PCR产物进行琼脂糖胶电泳检测。
通过荧光定量PCR（qRT-PCR）评估团头鲂SOCS家族基因在嗜水气单胞菌刺激后脾脏、体肾与头肾中的表达。qRT-PCR反应总体系为20.0 μL，包括SYBR混合试剂10.0 μL、ddH2O 7.4 μL、cDNA模板1.0 μL、上下游引物各0.8 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min后，95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸15 s，进行40个循环。
选择18S rRNA为内参基因，使用primer premier 5.0软件对团头鲂socs设计特异性上下游引物（
| 引物名称Primer name | 引物序列（5'-3'）Primer sequence (5'-3') | 用途Usage |
|---|---|---|
| SOCS1-f | CGCTAAAACGACAGATGAACCT | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS1-r | GCCTTGATTCCCTTCCACTG | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS2-F | CATTAGCACCCCATTATCA | 半定量PCR |
| SOCS2-R | TCAAGCCCAAACTCAAGCA | 半定量PCR |
| SOCS2-f | TCATTGTAGTCCACGCTGTT | qRT-PCR |
| SOCS2-r | GACAGCGTCGTCCATCTT | qRT-PCR |
| SOCS3a-f | GCTCAAGGTTTGTGCGTAG | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS3a-r | TCCGAGTTCAACAGGTGG | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS3b-f | CAAAGACGGACTGCTGAAGATAA | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS3b-r | TTGGCAAGAAGCAGTGGAAA | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS4-f | CTCTTCGCAACCACC | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS4-r | TGTGAGTGCCGTGTTT | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS5a-f | GTTTGCGAAAAAAATGCTATCA | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS5a-r | GGGAAGAAATGCCAACGG | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS5b-f | GTGGTGGTGCGTGGTGAG | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS5b-r | ACTTGAGGCTGACAGGCGA | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS6-f | ACGAATCTTCCAGACGGTT | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS6-r | AACAGGATTGGTCAGTCTAACA | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS7-f | GCCTCCTCTTCATTCAACC | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS7-r | GCTCCCTCCGTATCCGTAG | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS9-f | TTCGGGTTTGCCTTCCAG | 半定量PCR、qRT-PCR |
| SOCS9-r | CAGCATCGGATTCACACTCAA | 半定量PCR、qRT-PCR |
| 18S rRNA -f | TCGTCCACCGCAAATGCTTCTA | 半定量PCR、qRT-PCR |
| 18S rRNA-r | CCGTCACCTTCACCGTTCCAGT | 半定量PCR、qRT-PCR |
通过本地Blast比对NCBI中获得的斑马鱼SOCS家族基因与检索NCBI中团头鲂SOCS家族基因，共获得socs1、socs2、socs3a、socs3b、socs4、socs5a、socs5b、socs6、socs7、socs9共10个团头鲂socs基因序列，分别编码201、197、209、216、378、526、557、530、744、494个氨基酸，等电点（pI）分布在5.69~9.37，平均等电点为7.85，蛋白分子质量为22.3~80.97 ku，具体信息见
基因名 Gene name | ORF长度/bp ORF length | 编码蛋白 Encoded protein | ||
|---|---|---|---|---|
| 氨基酸长度Amino acids | 等电点 pI | 分子质量/ku Molecular weight | ||
| socs1 | 606 | 201 | 9.37 | 23.04 |
| socs2 | 594 | 197 | 8.39 | 22.31 |
| socs3a | 630 | 209 | 9.26 | 23.83 |
| socs3b | 651 | 216 | 7.76 | 23.79 |
| socs4 | 1 137 | 378 | 8.85 | 43.23 |
| socs5a | 1 581 | 526 | 7.34 | 58.45 |
| socs5b | 1 674 | 557 | 8.71 | 62.10 |
| socs6 | 1 593 | 530 | 5.69 | 59.24 |
| socs7 | 2 235 | 744 | 6.33 | 80.97 |
| socs9 | 1 485 | 494 | 6.75 | 55.34 |
预测团头鲂10个socs基因结构，结果如
图1 团头鲂socs基因结构图
Fig.1 Gene structure of socs in M. amblycephala
线条代表内含子，长方形代表外显子，黑色区域为ORF区。Lines represent introns， rectangles represent the exons， and black areas are ORF areas.
图2 团头鲂SOCS家族蛋白结构域
Fig.2 Protein domains of SOCS family in M. amblycephala
通过MEGA构建SOCS系统进化树，结果如
图3 脊椎动物SOCS系统进化树
Fig.3 Phylogenetic analysis of SOCS in vertebrates
半定量PCR结果（
图4 SOCS家族基因在团头鲂不同组织中的表达
Fig.4 Expressions of 10 SOCS family genes in various tissues of M. amblycephala
H：心脏； L：肝脏； S：脾脏； K：体肾； HK：头肾； B：脑； BL：血液；I：肠； M：肌肉； G：鳃。H： Heart； L： Liver； S： Spleen； K： Kidney； HK： Head-kidney； B： Brain； BL： Blood； I： Intestine； M： Muscle； G： Gill.
通过qRT-PCR结果可知，嗜水气单胞菌感染后，团头鲂脾脏中sosc5a、sosc5b、sosc6、sosc9表达量无明显差异，sosc1、sosc3a、sosc3b表达量在嗜水气单胞菌感染后呈现先上升后下降的趋势，且均在12 h达到峰值；sosc2、sosc7表达量在嗜水气单胞菌感染后4 h均出现显著下调，sosc2表达量在12 h出现短暂回升并于感染后24 h再次显著下调，sosc7表达量则是在24 h出现上调表达后于72 h恢复至初始水平；sosc4表达量在嗜水气单胞菌感染后先显著下调后逐渐回升至初始水平（
图5 嗜水气单胞菌感染后SOCS家族基因在团头鲂脾脏（A）、体肾（B）和头肾（C）中的表达量
Fig.5 Relative expression of SOCS family gene in spleen （A）， kidney （B） and head kidney （C） of M. amblycephala after infection by Aeromonas hydrophila
差异通过单因素方差分析（ANOVA）确定。18s为内参基因。“*”表示差异显著（P<0.05），“**”表示差异极显著（P<0.01）。The difference was determined by ANOVA. 18S is the internal reference gene. “*” means significant difference （P<0.05）， while “**” means extremely significant difference （P<0.01）.
嗜水气单胞菌感染后，团头鲂体肾中sosc4、sosc5b、sosc9表达量无明显差异，sosc1、sosc3a、sosc3b表达量变化趋势与脾脏中一致，其中sosc1与sosc3a在感染后12 h达到峰值，sosc3b在感染后24 h达到峰值；sosc6、sosc7表达量呈现先上升后下降的趋势；sosc2在4 h表达显著上调，在12 h出现短暂回落并于感染后24 h再次显著上调，在72 h恢复至初始水平；sosc5a表达量在在嗜水气单胞菌感染后出现下调，24 h出现短暂轻微上调后再次下调（
嗜水气单胞菌感染后，团头鲂头肾中sosc2、sosc5a表达量无明显差异，sosc1、sosc3a、sosc3b、sosc6表达量仍呈现先上升后下降的趋势，均在感染后12 h时达到峰值；sosc4、sosc5b、sosc9、sosc7表达量在嗜水气单胞菌感染后出现下调现象，其中sosc4在感染后24 h出现短暂回升但未恢复至初始水平，72 h再次出现下调趋势；sosc7在短暂下调后24 h出现回升，72 h后恢复至初始水平（
细胞因子具有多效性，它在免疫调节、细胞增殖以及受损组织修复等多个过程中发挥着重要作
系统进化分析表明，10个SOCS可分为2个亚族：Ⅰ型家族中包括SOCS4、SOCS5a、SOCS5b、SOCS6、SOCS7与SOCS9，Ⅱ型家族包括SOCS1、SOCS2、SOCS3a与SOCS3b，这与梭鱼等物种中已有研究结果一
健康团头鲂半定量PCR结果显示，socs1和socs9在心脏中表达量较高；socs3a、socs6与socs3b在肝脏中表达量较高，细胞因子在葡萄糖代谢、脂肪代谢以及蛋白质代谢过程中均有参与，那么SOCS作为细胞因子信号抑制蛋白的1种，在团头鲂重要代谢器官肝脏中具有高表达可能与此有一定关系。脾脏与体肾是鱼体重要的免疫器
在鱼类中，Poly（I：C）、LPS和细菌已被证明能够影响socs基因的表
综上所述，本研究初步探究了团头鲂10个SOCS分子特征，分析了其在健康团头鲂中的组织分布及嗜水气单胞菌胁迫下的表达模式，可为进一步研究团头鲂SOCS家族基因功能奠定基础。
参考文献References
YASUKAWA H，SASAKI A，YOSHIMURA A.Negative regulation of cytokine signaling pathways［J］.Annual review of immunology，2000，18（10）：143-164. [百度学术]
FLETCHER T C，DIGIANDOMENICO A，HAWIGER J.Extended anti-inflammatory action of a degradation-resistant mutant of cell-penetrating suppressor of cytokine signaling 3［J］.The Journal of biological chemistry，2010，285（24）：18727-18736. [百度学术]
YOSHIMURA A，OHKUBO T，KIGUCHI T，et al.A novel cytokine-inducible gene CIS encodes an SH2-containing protein that binds to tyrosine-phosphorylated interleukin 3 and erythropoietin receptors［J］.The EMBO journal，1995，14（12）：2816-2826. [百度学术]
NAKA T，NARAZAKI M，HIRATA M，et al.Structure and function of a new STAT-induced STAT inhibitor［J］.Nature，1997，387（6636）：924-929. [百度学术]
HILTON D J，RICHARDSON R T，ALEXANDER W S，et al.Twenty proteins containing a C-terminal SOCS box form five structural classes［J］.PNAS，1998，95（1）：114-119. [百度学术]
SHUAI K，LIU B.Regulation of JAK–STAT signalling in the immune system［J］.Nature reviews immunology，2003，3（11）：900-911. [百度学术]
CROKER B A，KIU H，NICHOLSON S E.SOCS regulation of the JAK/STAT signalling pathway［J］.Seminars in cell & developmental biology，2008，19（4）：414-422. [百度学术]
METCALF D，MIFSUD S，DI RAGO L，et al.Polycystic kidneys and chronic inflammatory lesions are the delayed consequences of loss of the suppressor of cytokine signaling-1 （SOCS-1）［J］.PNAS，2002，99（2）：943-948. [百度学术]
YASUKAWA H，MISAWA H，SAKAMOTO H，et al.The JAK-binding protein JAB inhibits Janus tyrosine kinase activity through binding in the activation loop［J］.The EMBO journal，1999，18（5）：1309-1320. [百度学术]
LI L，GRØNNING L M，ANDERSON P O，et al.Insulin induces SOCS-6 expression and its binding to the p85 monomer of phosphoinositide 3-kinase，resulting in improvement in glucose metabolism［J］.Journal of biological chemistry，2004，279（33）：34107-34114. [百度学术]
HAO L X，SUN L.Comparative analysis of the expression patterns of eight suppressors of cytokine signaling in tongue sole，Cynoglossus semilaevis［J］.Fish & shellfish immunology，2016，55：595-601. [百度学术]
THANASAKSIRI K，HIRONO I，KONDO H.Identification and expression analysis of suppressors of cytokine signaling （SOCS） of Japanese flounder Paralichthys olivaceus［J］.Fish & shellfish immunology，2016，58：145-152. [百度学术]
YAO J，MU W J，LIU S K，et al.Identification，phylogeny and expression analysis of suppressors of cytokine signaling in channel catfish［J］.Molecular immunology，2015，64（2）：276-284. [百度学术]
张建，王济秀，吴晓丽，等.团头鲂TYK2基因的克隆与表达分析［J］.华中农业大学学报，2021，40（2）：197-205.ZHANG J，WANG J X，WU X L，et al.Molecular cloning and expression of TYK2 in Megalobrama amblycephala［J］.Journal of Huazhong Agricultural University，2021，40（2）：197-205（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
柴欣.团头鲂MHCⅡα基因的SNP位点开发、鉴定及与抗病性状关联分析［D］.武汉：华中农业大学，2017.CHAI X.SNPs screening and identification of MHC ⅡA gene in blunt snout bream（Megalobrama amblycephala） and their association with disease resistance trait［D］.Wuhan：Huazhong Agricultural University，2017（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
张建.团头鲂JAK家族基因的鉴定和表达分析［D］.武汉：华中农业大学，2020.ZHANG J.Identification and expression analysis of JAK family genes in Megalobrama amblycephala［D］.Wuhan：Huazhong Agricultural University，2020（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
WANG G W，SUN Q H，WANG H L，et al.Identification and characterization of circRNAs in the liver of blunt snout bream （Megalobrama amblycephala） infected with Aeromonas hydrophila［J/OL］.Developmental & comparative immunology，2021，124：104185［2022-05-31］.https：//doi.org/10.1016/j.dci.2021.104185. [百度学术]
JIN H J，SHAO J Z，XIANG L X，et al.Global identification and comparative analysis of SOCS genes in fish：insights into the molecular evolution of SOCS family［J］.Molecular immunology，2008，45（5）：1258-1268. [百度学术]
刘春来，刘红雨，陈军.SOCS家族分子在肿瘤发生发展中的作用［J］.中国肺癌杂志，2016，19（9）：620-625.LIU C L，LIU H Y，CHEN J.The role of SOCS in the development of tumors［J］.Chinese journal of lung cancer，2016，19（9）：620-625（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
XU T B，SU J G.Genome-wide identification，evolution，and transcriptome-based expression profiling analysis of suppressors of cytokine signaling （SOCS） in grass carp （Ctenopharyngodon idella）［J/OL］.Aquaculture，2021，536：736484［2022-05-31］.https：//doi.org/10.1016/j.aquaculture.2021.736484. [百度学术]
宋云杰.梭鱼SOCS家族基因的克隆与表达分析［D］.上海：上海海洋大学，2019.SONG Y J.Identification and expression analysis of suppressors of cytokine signaling （SOCS） from soiny mullet （Liza haematocheila）［D］.Shanghai：Shanghai Ocean University，2019（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
LI J，ZHANG Y，ZHANG Y H，et al.Cloning and characterization of three suppressors of cytokine signaling （SOCS） genes from the Pacific oyster，Crassostrea gigas［J］.Fish & shellfish immunology，2015，44（2）：525-532. [百度学术]
RAWLINGS J S，RENNEBECK G，HARRISON S M W，et al.Two Drosophila suppressors of cytokine signaling （SOCS） differentially regulate JAK and EGFR pathway activities［J/OL］.BMC cell biology，2004，5（1）：38［2022-05-31］.https：//doi.org/doi： 10.1186/1471-2121-5-38. [百度学术]
罗智文，董志祥，林连兵，等.鱼类重要免疫器官抗菌机制的研究进展［J］.水产科学，2021，40（4）：624-634.LUO Z W，DONG Z X，LIN L B，et al.Advances on immunological mechanisms of important immune organs against pathogenic microorganisms in fish：a review［J］.Fisheries science，2021，40（4）：624-634（in Chinese）. [百度学术]
TURNLEY A M.Role of SOCS2 in growth hormone actions［J］.Trends in endocrinology & metabolism，2005，16（2）：53-58. [百度学术]
WANG T H，GAO Q，NIE P，et al.Identification of suppressor of cytokine signalling （SOCS） 6，7，9 and CISH in rainbow trout Oncorhynchus mykiss and analysis of their expression in relation to other known trout SOCS［J］.Fish & shellfish immunology，2010，29（4）：656-667. [百度学术]
谢业扬.卵形鲳鲹Ⅱ型SOCS基因的克隆与表达分析［D］.南宁：广西大学，2020.XIE Y Y.Identification and expression analysis of typeⅡ SOCS genes from goiden pompano （Trachinotus ovatus）［D］.Nanning：Guangxi University，2020（in Chinese with English abstract）. [百度学术]