摘要
为探明鱼类咽齿发生发育的分子机制，以我国特有的经济鱼类团头鲂（Megalobrama amblycephala）为研究对象，通过团头鲂全基因组序列Blast获得团头鲂分泌型钙结合磷蛋白（secretory calciumbinding phosphoprotein，SCPP）家族基因的cDNA序列，采用实时荧光定量的方法比较分析SCPP家族基因在团头鲂咽齿发生发育关键时期第四、第五鳃弓中的表达情况，以及在1龄团头鲂不同组织中的表达情况，筛选调控咽齿发育的关键调控基因。研究结果显示，团头鲂enam、scpp1、ambn、scpp9、odam、spp1与斑马鱼具有较高同源性，进化树中距离较近；通过比对不同脊椎动物enam与odam这2个基因编码的氨基酸序列，发现在鱼类中均存在2段氨基酸序列的缺失。1龄团头鲂不同组织的SCPP家族基因定量表达结果显示，enam、scpp1、ambn、scpp9和spp1在第五鳃弓（有咽齿）和肋骨里面有很高的表达量，与其他组织中的表达水平大多存在显著性差异（P<0.05），且在第四鳃弓（无咽齿）中的表达量最低。团头鲂第四、第五鳃弓早期（9~54 d）咽齿发育阶段定量结果显示enam、ambn、scpp9、odam、spp1在第五鳃弓表达量显著高于第四鳃弓表达量，其中scpp9在第五鳃弓中的表达量极高。以上研究结果表明enam、scpp1、ambn、scpp9、odam、spp1均参与团头鲂咽齿发育的调控，其中scpp9在团头鲂咽齿发育过程中调控作用较为明显，推测其与咽齿发育关系更为密切。
分泌型钙结合磷蛋白（secretory calciumbinding phosphoprotein，SCPP）基因家族编码的多种磷酸蛋白参与骨的骨
鱼类已有SCPP家族基因研究主要集中于从基因组水平比较基因序列的差异，这些差异可能与矿化组织的表型转化有
团头鲂（Megalobrama amblycephala）又名武昌鱼，是我国特有的草食性经济鱼类之一，具有营养价值高、生长较快、存活率高和易捕捞等特点，华中农业大学王卫民、高泽霞团队针对其种质资源保护及遗传改良方向进行了相关研
试验所用团头鲂均来自湖北省阳新县百容水产良种有限公司（湖北省黄石市阳新县浮屠镇）。试验共采集3尾1龄团头鲂第五鳃弓（含咽齿）、第四鳃弓（不含咽齿）、肌间刺、大脑、鳍条、心脏、肝脏、脾脏、肌肉、肋骨10种组织样品，每个组织3个样品。同时，分别采集鱼苗孵出后9、18、27、36、45、54 d团头鲂的第五和第四鳃弓，每个阶段3个重复样品。所有采样用鱼使用MS-222麻醉后进行采样，样品采集完成后置于液氮中速冻后，转入-80 ℃冰箱保存、备用。
取-80 ℃冻存的9~54 d团头鲂第四、第五鳃弓及1龄团头鲂10种组织样品，用Trizol法（TAKARA，大连）提取总RNA并电泳检测完整性，NanoDrop ND-2000核酸蛋白仪（Thermo，美国）测定RNA浓度及OD值。按照HiScript®ⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒（Vazyme，南京）的说明书合成各样品的cDNA，将合成的cDNA稀释5倍后，置于-20 ℃冰箱保存。
Ensembl网站上下载斑马鱼enam（ENSDART00000132089.3）、scpp1（ENSDART00000127579.3）、ambn（ENSDART00000121605.4）、scpp9（ENSDART00000129813.2）、odam（ENSDART00000137646.3）和spp1（ENSDART00000101261.6）的cDNA序列，与团头鲂的全基因组序
利用NCBI的ORF finder程序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析基因开放阅读框；使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析6个SCPP家族基因的理化性质。使用DNAMAN软件对不同脊椎动物6个SCPP家族基因进行同源性分析，并使用MEGA7.0软件构建基因系统进化树。进化树各基因物种信息如下：
enam：人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、小鼠（Mus musculus）、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、鲤（Cyprinus carpio）、斑马鱼（Danio rerio）、大黄鱼（Larimichthys crocea）、雀鳝（Lepisosteus oculatus）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）、青鳉（Oryzias latipes）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、秀美花鳉（Poecilia formosa）；
scpp1：半滑舌鳎、斑马鱼、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）、大黄鱼、雀鳝、团头鲂、青鳉、牙鲆、红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）；
ambn：人、牛、斑马鱼、雀鳝、团头鲂、小鼠；
scpp9：雀鳝、鲤、斑马鱼、团头鲂、青鳉、秀美花鳉；
odam：人、牛、小鼠、半滑舌鳎、鲤、斑马鱼、斑点叉尾鮰、大黄鱼、团头鲂、黄鳝（Monopterus albus）、青鳉、牙鲆、秀美花鳉、红鳍东方鲀；
spp1：人、牛、半滑舌鳎、斑马鱼、斑点叉尾鮰、大黄鱼、雀鳝、团头鲂、小鼠、青鳉、牙鲆、秀美花鳉、红鳍东方鲀。
参照Blast获得的6个基因的序列信息，以β-actin为内参，利用NCBI网站的Primer-Blast设计其定量引物。由武汉擎科公司合成（
基因 Gene | 引物序列（5’-3’） Primer sequence | 退火温度/℃ Annealing temperature | 扩增片段长度/bp Amplified length |
|---|---|---|---|
| enam | F:TTACCCTCCCTACGGCTACC | 62 | 194 |
| R:AAGGTTCGACGGGAACATCC | |||
| scpp1 | F:AAGAGGATAACGGTGCCGAC | 62 | 190 |
| R:TCGCTGTCACATTCTTGGCT | |||
| ambn | F:GCCTGCGTTTAGAGGCAATG | 62 | 118 |
| R:GGTCATTCCATTGGCAGGGA | |||
| scpp9 | F:GCAGCTGCTCTTTCCCCATA | 62 | 101 |
| R:GGAGCGAAAGGGTAAGCCAT | |||
| odam | F:AGGGCAGCCTCCATTAACAC | 62 | 172 |
| R:CTGGGGCCCACCAATGTAAT | |||
| spp1 | F:GAGAAACTGAGACCACCGCA | 62 | 188 |
| R:ACCGCCCAACTTTTCATTGC | |||
| β-actin | F：ACCCACACCGTGCCCATCTA | 62 | 204 |
| R：CGGACAATTTCTCTTTCGGCTG |
利用Blast获得了团头鲂SCPP基因家族6个咽齿发育相关基因的cDNA核心序列，根据ProtParam软件预测结果显示各基因的理化性质如
| 参数 Parameter | enam | scpp1 | ambn | scpp9 | odam | spp1 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CDS序列/bp CDS sequence | 735 | 756 | 948 | 987 | 2 130 | 1 077 |
|
编码氨基酸个数 Number of coding amino acids | 244 | 251 | 315 | 329 | 709 | 358 |
| 分子质量/ku Molecular weight | 24.85 | 26.91 | 33.90 | 34.54 | 76.97 | 38.49 |
| 理论等电点 pI | 3.67 | 4.15 | 6.01 | 9.22 | 5.73 | 4.16 |
| 蛋白质性质 Protein properties | 酸性 Acidity | 酸性 Acidity | 酸性 Acidity | 碱性 Alkalinity | 酸性 Acidity | 酸性 Acidity |
| 消光系数 Extinction coefficient | 7 575 | 17 085 | 14 565 | 20 400 | 58 300 | 10 555 |
| 不稳定系数 Instability coefficient | 58.47 | 79.13 | 64.65 | 62.72 | 44.61 | 68.92 |
| 稳定性 Stability | 不稳定 Unstable | 不稳定 Unstable | 不稳定 Unstable | 不稳定 Unstable | 不稳定 Unstable | 不稳定 Unstable |
| 疏水指数 Hydrophobic index | 84.96 | 50.16 | 73.59 | 83.86 | 81.07 | 55.39 |
| 平均亲水性 Hydrophilicity | 0.082 | -0.976 | -0.267 | -0.188 | -0.197 | -0.885 |
使用DNAman软件对人、鼠、牛、团头鲂及其他鱼类enam、scpp1、ambn、scpp9、odam与spp1编码的氨基酸序列进行同源性比较，并使用MEGA软件构建进化树。结果显示，团头鲂enam编码的氨基酸序列与斑马鱼（16.47%）、鲤（13.56%）具有相对较高的同源性（
图1 团头鲂SCPP家族基因与其他脊椎动物基因的同源性比较
Fig.1 Comparison of homology between SCPP family genes of M. amblycephala and genes of other vertebrates
1：人Homo sapiens； 2：鼠Mus musculus； 3：牛Bos taurus； 4：鲤Cyprinus carpio； 5：斑马鱼Danio rerio； 6：斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus； 7：黄鳝 Monopterus albus； 8：大黄鱼Larimichthys crocea； 9：牙鲆Paralichthys olivaceus； 10：青鳉Oryzias latipes； 11：亚马逊花鳉Poecilia formosa； 12：斑点雀鳝Lepisosteus oculatus； 13：半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis； 14：红鳍东方鲀Takifugu rubripes.
图2 团头鲂SCPP家族基因与其他脊椎动物基因的系统进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of SCPP family genes between M. amblycephala and other vertebrates
A： enam； B： scpp1； C： ambn； D： scpp9； E： odam； F： spp1.
图3 不同脊椎动物enam和odam部分编码序列比对分析
Fig.3 Partial alignment sequences of enam and odam in the different vertebrates
A： enam； B： odam. 红色箭头标注位置为鱼类相比于哺乳动物氨基酸序列缺失位点。Red arrow marks the position of the deletion of fish compared with mammalian amino acid sequence.
采用qRT-PCR方法分析1龄团头鲂enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1在不同组织中的表达情况，结果（
图4 团头鲂SCPP家族基因在不同组织的相对表达量
Fig.4 Relative expression of SCPP family genes in the different tissues of M. amblycephala
A： enam； B： scpp1； C： ambn； D： scpp9； E： odam； F： spp1. 1：第四鳃弓Gill arch 4； 2：第五鳃弓Gill arch 5； 3：肌间骨Intermuscular bone； 4：脑Brain； 5：鳍条Fin； 6：心脏Heart； 7：肝Liver；8 ：脾Spleen； 9：肌肉Muscle； 10：肋骨Rib。不同小写字母表示各基因在不同组织中具有显著性差异（P<0.05）。Different lowercase letters indicate the significant difference for different genes in the different tissues， respectively （P<0.05）.
基因表达分析结果如
图5 团头鲂SCPP家族基因在早期咽齿发育阶段的相对表达量
Fig.5 Relative expression of SCPP family genes in the early pharyngeal tooth developmental stages in M. amblycephala
A： enam； B： scpp1； C： ambn； D： scpp9； E： odam； F： spp1. GA4：第四鳃弓Gill arch 4；GA5：第五鳃弓Gill arch 5.
本研究中系统进化分析表明，enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1在鲤科鱼类与人、鼠和鸡等高等脊椎动物类都各自聚为一支，青鳉与秀美花鳉enam、scpp9、odam和spp1基因聚为一支，这表明这2个物种不仅亲缘关系较为接近，且与咽齿发育的形成潜在相关。在enam基因的进化树中斑点雀鳝与人、鼠、鸡等高等脊椎动物聚为一支，推测鱼类的enam在基因复制过程中发生了功能的分
已有研究表明分泌型钙结合磷蛋白（SCPP）基因家族对咽齿的形成至关重
enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因在1龄团头鲂不同组织中的表达分析结果显示，enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因在1龄团头鲂的第五鳃弓表达量显著高于第四鳃弓（P<0.05），且在肋骨中也有较高的表达，这与Kawasaki
本研究通过对咽齿发育相关的enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因的CDS区克隆和同源性分析，推测鱼类SCPP基因与鱼类咽齿发育相关。结合团头鲂9~54 d第四、第五鳃弓和1龄团头鲂不同组织的基因表达分析，明确了enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因的表达与鱼类咽齿发育具有一定的相关性。
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