摘要
为进一步压缩检测时长、实现进出口食品快速通关,研制阵列装置用于多毒素同步快速检测。设计并以3D打印技术构建了卧式和立式2种适配于胶体金侧流免疫分析(LFIA)试纸的阵列装置,并对装置的性能进行评价。以阵列装置同时集成黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等4种真菌毒素的LFIA试纸并应用于玉米、玉米面和麦仁等食品的检测。试验结果显示:4种毒素的检测限分别达0.031、0.190、0.780、0.220 ng/mL,回收率为74.42%~112.40%,结果无交叉反应,包括前处理时间在内单一样品的四指标同步检测可在40 min内完成。
黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是丝状真菌产生的有毒次级代谢产物,可在生物体内积累。这些真菌毒素的主要毒性包括致癌性、雌激素和生殖毒性、致突变性和肝肾毒性物质、致畸性和免疫抑制,对人类和动物健康构成严重危
目前,霉菌毒素复合检测方法主要有仪器分析法和免疫分析法。仪器检测方法,如高效液相色谱法(HPLC
侧流免疫层析分析法(LFIA)作为一种新兴的检测技术,具有速度快、检测限低(LOD)、特异性好、成本低和耗样少等优
3D打印技术简化了产品的制造程序,减少了产品的制造时间和耗材用量,可制造复杂结构零件并且无需组装,可实现精确实体复制以及个性化定
本研究以北京华安麦科生物技术有限公司的4种毒素快检试纸的尺寸为参考,设计基于快检试纸条的阵列装置。利用3D打印技术构建适配于试纸的阵列装置,可实现多真菌毒素平行同步快速检测,为口岸粮食筛查和快速通关提供切实可行的技术支撑。
Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaOH、乙腈、无水乙醇等均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;去离子水,杭州娃哈哈集团有限公司;聚乳酸(直径1.75 mm),珠海京天乐购科技有限公司;黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A以及玉米赤霉烯酮快速检测试纸条均为北京华安麦科生物技术有限公司。真菌毒素标准品包括黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮,青岛普瑞邦生物工程有限公司。玉米、玉米面、麦仁、花生、燕麦、薏仁、小麦、大米粮食样品采购于当地农贸市场。
Vortex 2 涡旋混匀仪,德国IKA公司;5804R离心机,德国艾本德股份公司;ST3100实验室pH计,美国奥豪斯仪器有限公司;Z603S工业高精度3D打印机,深圳市极光尔沃科技股份有限公司;荣耀30智能手机,中国华为技术有限公司;MZ-4000样本前处理一体机,山东美正生物科技有限公司;KJ-120快速检测工具箱,山东美正生物科技有限公司。
3D建模由AutoCAD 2018软件完成;3D打印由极光尔沃Z603S工业高精度3D打印机结合控制软件Cura-15.02.1完成,其主要参数设置为:填充密度为20%、打印速度为30 mm/s、喷头温度为200 ℃、热床温度为50 ℃,其他参数保持初始设定。
设计了一种卧式同步快检侧流层析试纸阵列装置,阵列装置由两部分组成,试纸阵列板a与宽度、承重均合适的样液盒b相匹配(

图1 卧式同步快检侧流层析试纸阵列装置
Fig.1 Schematic diagram of horizontal synchronous rapid inspection lateral flow chromatography array device
A:组成结构以及处于测试工作状态示意图Schematic diagram of composition structure and working state under test;B:装置三视图Three-view of device;C:优化后结构及尺寸(mm) Optimized structure and size (unit: mm);D:打印成品图以及应用情况Printing of finished drawings and the application situation.
当卧式试纸阵列装置处于测试工作状态时(
在使用装置时发现,4种样液混合后,金标探针的稀释倍数增大,不符合单条试纸线性规律的应用要求,如增加金标探针的用量,经济成本过大;同时AFB1、ZEN、OTA、DON等4种毒素试纸所需最适缓冲体系的pH值区间分别为8、7~8、8~9、6~7,当4种缓冲液混合,缓冲体系的差异将干扰试纸的层析效果。为解决以上应用中存在的问题,对卧式同步快检侧流层析试纸阵列装置的结构进行优化。根据目前使用需求,槽道设置为4条,在样液盒b内添加隔板,形成4个均匀的隔档,使4种缓冲体系保持独立状态,隔档与槽道一一对应,供试纸插入。具体尺寸如
设计了一种立式同步快检侧流层析试纸阵列盒(

图2 立式同步快检侧流层析试纸阵列盒
Fig.2 Schematic diagram of vertical synchronous fast inspection lateral flow chromatography array box
A:组成结构以及处于测试工作状态示意图Schematic diagram of composition structure and working state under test;B:装置三视图Three-view of device;C:优化后结构及尺寸(mm) Optimized structure and size (unit: mm);D:打印成品图以及应用情况Printing of finished drawings and the application situation.
为解决本文“1.4”中提出的问题,对立式同步快检侧流层析试纸阵列盒的结构进行优化。根据目前使用需求,槽道设置为4条,除去样液储蓄盒左侧的加样通道,将槽道对应的样液储蓄盒分成4个储蓄分盒,达到4种缓冲体系加入后互不干扰的状态。具体尺寸如
当立式试纸阵列装置处于测试工作状态时(
预先用乙腈配制0.1 mg/mL AFB1、ZEN、OTA、DON标品溶液,用PBS(10 mmol/L,pH 7.4)进行稀释。AFB1的质量浓度依次为0、0.1、0.5、1、2、3 ng/mL;ZEN的质量浓度依次为0、1、10、25、50、60、70、80、100 ng/mL;OTA的质量浓度依次为0、1、10、20、40、60、80、100、120、200、300 ng/mL;DON的质量浓度依次为0、10、50、100、200、400、800、1 600、3 200、6 400、12 800、15 000、18 000 ng/mL。
最佳试验条件下,将金标抗体、200 μL不同质量浓度的毒素标品溶液与相应试纸缓冲液的混合液(V标品液︰V稀释液=1︰5),在室温下孵育5 min,然后将试纸条插入进行层析,静等25 min目测读取试验结果,并利用智能手机采集结果图像,采用Image J软件(http://cnij.imjoy.io/)对图像结果进行灰度分析。以公式LOD=`x+3s(`x为对11个空白样品的测试均值,s为测试的标准偏差)计算得到方法的检测限。以T区消线的毒素浓度作为试纸最高检出限的判定标准。
评定4种试纸条在4种毒素间的特异性。分别配制质量浓度为5、120、400、6 400 ng/mL的AFB1溶液、ZEN溶液、OTA溶液和DON溶液待用。用AFB1试纸缓冲液、ZEN试纸缓冲液、OTA试纸缓冲液、DON试纸缓冲液对4种毒素溶液分别进行稀释混合5 min(V毒素溶液︰V稀释液=1︰5)。取混合液200 μL,用试纸条进行特异性试验,25 min后目测读取试验结果,并利用智能手机采集结果图像,采用Image J软件对图像结果进行灰度分析。
1)选取玉米、玉米面、麦仁、花生、燕麦、薏仁、小麦、大米8种粮食样品,利用试纸及阵列装置进行4种毒素的检测分析。粮食样品前处理:称取5.0 g粮食样品均质,过孔径0.85 nm筛网,加入12 mL 50%乙醇-水溶液,充分振荡混合(150 r/min,3 min),离心(4 000 r/min,5 min),除去沉淀,吸取上清液待用。用AFB1试纸缓冲液、ZEN试纸缓冲液、OTA试纸缓冲液、DON试纸缓冲液对上清液进行稀释混合5 min(V上清液︰V稀释液=1︰5)。取混合液200 μL,用试纸条进行实际样品检测试验,25 min后目测读取试验结果,并利用智能手机采集结果图像,采用Image J软件对图像结果进行灰度分析。
2)玉米、玉米面、麦仁样品的加标检测。AFB1的加标质量浓度分别为0、0.1、1 ng/mL;ZEN的加标质量浓度分别为0、1、10 ng/mL;OTA的加标质量浓度分别为0、10、100 ng/mL;DON的加标质量浓度分别为0、10、100 ng/mL。分别用AFB1试纸缓冲液、ZEN试纸缓冲液、OTA试纸缓冲液、DON试纸缓冲液对加标粮食上清液进行稀释混合5 min(V上清液/V稀释液=1︰5)。取混合液200 μL,用试纸条进行实际样品加标检测实验,25 min后目测读取试验结果,并利用智能手机采集结果图像,采用Image J软件对图像结果进行灰度分析。
首先由7名独立评价员在相同试验环境以及规定时间内,分别使用卧式、立式2种阵列装置,对同一批次的试验样品(均为阴性样品),进行完整的检测操作,并对装置的使用效果进行描述性检验评价。由2种装置的特征可知,卧式阵列装置具有易操作、灵活性强、重复利用性高、暴露性高、易受污染等特点,因其良好的操作性以及重复利用性,更适用于实验室环境的检测;立式阵列装置具有操作性欠佳、体积小、轻便、密闭性好、重复利用性低等特点,因其轻便以及密闭性佳更适用于现场检测。其次从简单描述检验结果中选取易操作性、灵活性、重复利用性、便携性以及现场适用性等5种特征进行定量评价,与普通胶体金试纸检测方法的特征进行比较,讨论制定统一标尺,特征强度指标为1~9分(由弱至强),由7名评价员独立进行评定,试验结果如

图3 试纸阵列装置描述性评定结果
Fig.3 Descriptive evaluation results of dipstick array device
为便于操作,将4种毒素试纸采用统一的测试条件,测定了一系列不同质量浓度毒素标准溶液,确定4种试纸的最高检出限值、检测限、线性范围。AFB1、ZEN、OTA、DON试纸结果如

图E中1,2,3,4分别对应图4的A,B,C,D。1,2,3 and 4 in Fig.4 E correspond to A,B,C and D in Fig.4 respectively.图4 4种试纸对AFB1(A),ZEN(B),OTA(C)和DON(D)的分析性能试验结果
Fig.4 Experimental results and images of analytical performance of AFB1 (A),ZEN (B),OTA (C) and DON (D) test strips
分别以5、120、400、6 400 ng/mL的AFB1溶液、ZEN溶液、OTA溶液和DON溶液进行特异性试验,以验证本方法对毒素的选择性。非特定毒素不能被抗体特异性识别并结合,因而不能与固定在T区的毒素包被原竞争结合金纳米标记抗体,抗体被毒素包被原捕获,T区显色;反之,目标物与抗体结合的亲和力越高,结合在T区的抗体越少,显色越浅。试验结果如

图5 4种试纸的特异性试验结果
Fig.5 Test results and images of AFB1(A),ZEN (B),OTA(C),DON(D) test strips
图E中1,2,3,4分别对应图5的A,B,C,D。1,2,3 and 4 in Fig.5E correspond to A,B,C and D in Fig. 5,respectively.
1)粮食样品检测。在当地农贸市场购买粮食样品后,在现场利用MZ-4000样本前处理一体机以及KJ-120快速检测工具箱进行样品前处理,然后采用所构建的卧式同步快检侧流层析试纸阵列装置以及4种毒素试纸检测了玉米、玉米面、麦仁、花生、燕麦、薏仁、小麦、大米等8类粮食样品的毒素污染情况,检测结果如
注 Note:LOD:检测限 Limit of detection;ND:未检出 Not detected.
2)加标粮食样品的检测。对最易同时受到4种毒素污染的玉米、玉米面、麦仁样品进行加标回收试验,以验证本方法的准确性和实际样品检测能力。样品中分别加入不同质量浓度(0、0.1、1 ng/mL)的AFB1、(0、1、10、100 ng/mL)的ZEN、(0、1、10、100 ng/mL)的OTA、(0、10、100、1 000 ng/mL)的DON。测定4种毒素含量,试验结果如
注 Note: LOD:检测限Limit of detection;NC:未计算Not calculated;ND:未检出Not detected.
传统的真菌毒素胶体金试纸可通过肉眼观察检测区的信号对目标物进行定性分析,在定量检测方面仍待完善。为提高其检测通量,研究人员开发了具有多条检测线的快检试纸,多条通路间的干扰难以避免,时间上同步的检测效果仍未实现。利用3D打印技术设计并构建小型阵列装置,将多条不同目标物的试纸集成为一体,对样品同时层析进行检测,可避免上述问题,达到高通量同步快速检测的目的,有助于同时监测多种真菌毒素的污染状况,保障粮食品质,提高口岸粮食筛查的效率。
本研究开发新型阵列装置用于准确、快速、现场检测粮食谷物中的AFB1、ZEN、OTA、DON,实现一步同时侧流层析检测。设计目标有以下几点:(1)设计并构建装置,达到多条侧流层析试纸同时进行层析的效果,装置便携且易于推广;(2)装置由尺寸匹配的两部分组成,两部分可以组合或连接的方式搭配进行使用;(3)装置的一部分以多条槽道及夹层的形式用于固定试纸的吸水垫端;(4)装置的第二部分用于收集并储存样液;(5)装置操作简便,可工厂化批量生产。利用装置对8类粮食样品进行定量检测与毒素污染情况分析,加标实际样品的回收率结果良好,应用场景范围覆盖常见且易受真菌毒素污染的谷物食品。真正实现了时间同步、平行又互不影响的阵列试纸,保障检测质量的同时提高了效率。研究过程中发现由于不同毒素试纸所需缓冲体系的pH值存在较大差异,目前尚未找到一种同时适合4种毒素检测环境的缓冲体系以进一步简化操作流程,有待进一步探究。本研究中设计的阵列装置通过真空塑封,与不同试纸组合,可发展为一次性产业化商品,为广阔的市场提供方案支持。同时,此方法可拓展应用于其他种类分析物的同步快检。
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