摘要
为实现谷物中呕吐毒素（deoxynivalenol，DON）的快速、灵敏检测，采用生物传感和化学发光技术相结合的方式，研制应用于现场快速检测谷物中呕吐毒素的化学发光光纤免疫传感器，并搭建用于化学发光信号检测的便携式传感平台。整个检测平台集成到一个32 cm×15 cm×25 cm的黑色避光盒中，质量小于3 kg。结果显示：所研制的化学发光光纤免疫传感器在0.1~1 200 ng/mL呈现出良好的线性关系，检出限为62.7 pg/mL；功能化的光纤探针能够稳定保存30 d且具有良好的特异性和抗干扰性；其应用于谷物样品的呕吐毒素检测回收率为81.00%~107.33%，相对标准偏差小于8.69%。结果表明，该方法较ELISA法的灵敏度提高了30倍，线性范围拓宽了3个数量级，适合应用于谷物样品中呕吐毒素的现场快速检测。
呕吐毒素（deoxynivalenol，DON）是粉红镰刀菌、谷禾镰刀菌等镰刀菌群产生的一种单端孢霉烯族类代谢产物，属于剧毒或中等毒
目前，针对谷物中DON的检测方法主要有大型仪器分析
近年来，由免疫识别元件（抗原/抗体）与信号转换单元（如电、光、声、热等）组成的免疫传感器成为谷物中DON高效检测的有力工
呕吐毒素（DON）、鼠源呕吐毒素抗体（DON-Ab，3 mg/mL）、呕吐毒素完全抗原（DON-BSA，3.5 mg/mL）购自山东蓝都生物科技有限公司。HRP标山羊抗小鼠IgG（1 mg/mL）购自上海碧云天生物技术有限公司。吐温-20、甲苯、戊二醛（GA）、牛血清白蛋白（BSA）、氢氟酸（质量分数48%）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。Lumigen SPARCL™化学发光试剂盒购自广州市进德生物科技有限公司。
磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和磷酸盐吐温缓冲溶液（PBST含0.05% 吐温-20）均用美国Millipore公司的离子交换装置产生的去离子水制备。使用的其他普通化学品和试剂均为分析级，购自中国国药集团。大米、小麦、玉米样品由中国检验检疫科学研究院提供。
石英光纤（SFS400/440/700T Superguide UV-Vis）购自上海闻奕光电科技有限公司，数值孔径（NA）为0.22，光纤纤芯直径400 μm。
光子计数探测器（CH326）、光子计数单元（CH297-01）及其软件模块购自北京滨松光子技术有限公司。傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet iS5）购自美国赛默飞公司；扫描电子显微镜（FIB-910）购自德国蔡司公司；原子力显微镜（Alphacen 300）购自瑞士纳瑟公司；酶联免疫光谱分析仪（AQT90 FLES）购自丹麦雷度公司；液相色谱-质谱联用分析仪（Vanquish Core）购自美国赛默飞公司。
由化学发光光纤免疫传感器原理图（
图1 化学发光光纤免疫传感器检测呕吐毒素原理图
Fig.1 Schematic diagram of chemiluminescent fiber optic immunosensor for detection of DON
1）化学发光光纤探针的制备。首先将光纤切成6 cm的小段，用小刀刮去前端约为0.5 cm的亚克力保护壳。然后将光纤浸入24%氢氟酸中30 min，以去除光纤表面包层。用0.1 mol/L NaOH中和氢氟酸，并用超纯水洗净后氮气吹干。将光纤浸泡在0.1 mol/L NaOH中30 min以活化纤芯表面硅羟基。随后，处理过的光纤芯分别使用水和甲苯洗涤3次并浸入含APTES的甲苯溶液（体积分数1%）中引入氨基。氮气吹干后将光纤芯浸入体积分数2.5%戊二醛水溶液孵育2 h，洗净后将光纤插入5 μg/mL的DON-BSA中4 ℃避光孵育过夜，使用PBST洗涤3次。用5% BSA封闭未结合的位点，用PBST洗涤 3次后，保存于4 ℃。此时化学发光光纤免疫传感器已制备完成，放置于4 ℃备用。
2）DON检测过程。将制备好的光纤探针插入含有50 μL 鼠源DON抗体（10 μg/mL）和等体积不同浓度DON溶液的离心管中进行免疫反应，37 ℃孵育1 h，并用PBST洗涤3次。然后，将免疫反应后的光纤探针反应区插入1 μg/mL HRP标记山羊抗小鼠IgG中，37 ℃免疫反应30 min后，用PBST洗涤3次。最后将光纤免疫反应区域与20 μL化学发光底物吖啶酯（10 mg/mL）和20 μL触发剂（含0.1 mmol/L过氧化脲的Tris-HCl缓冲溶液）等体积混合溶液接触，通过光子计数器在避光条件下记录化学发光信号。
化学发光光纤免疫传感器检测装置由显示器、光纤固定器、试剂盘、旋转升降台、检测器、数据采集模块、电源7个部分组成，所有元件集成在一个32 cm×15 cm×25 cm黑色亚克力板搭建而成的避光盒中。如
图2 化学发光光纤免疫传感器检测平台的结构
Fig.2 Structure of the detection platform for chemiluminescent fiber optic immunosensor
为了验证生物识别分子在光纤纤芯上的标记效果以及光纤探针的表面形貌，本研究采用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）、能量色散光谱仪（EDS）对完全抗原修饰的光纤探针进行表征。使用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）对光纤表面的特定官能团和化学键进行分析，检测光谱波谱为500~4 000 c
以DON浓度为横坐标、化学发光信号强度的差值（ΔCL）为纵坐标，建立标准曲线，线性关系和相关系数
使用呕吐毒素（DON）、黄曲霉毒素（AFB1）、赭曲霉毒素（OTA）、玉米赤霉素烯酮（ZEN）对生物传感器特异性进行评估。所有真菌毒素均为1 μg/mL，其他反应条件相同，根据测得的化学发光差值ΔCL来评价该传感器对DON的特异性。
使用含有黄曲霉毒素（AFB1）、赭曲霉毒素（OTA）、玉米赤霉素烯酮（ZEN）的DON溶液评估该传感器的抗干扰能力。试验溶液分别为DON和AFB1溶液，DON和OTA溶液，DON和ZEN溶液，DON和谷蛋白混合溶液，DON和葡萄糖混合溶液，对照组为不含干扰抗原的DON溶液，所有真菌毒素均为1 μg/mL，谷蛋白为100 μg/mL，葡萄糖为1 mg/mL。其他反应条件相同，根据测得的化学发光差值ΔCL来评价该传感器的抗干扰能力。
首先，按照本文“1.3 1）”所述方法，制备15支光纤探针，并将其浸泡在PBS溶液中，4 ℃下避光保存30 d，每隔5 d检测1次化学发光强度，每次测试3组，每组1根，根据化学发光信号差值ΔCL判断光纤探针的稳定性。
分别称量10.0 g小麦、大米和玉米样品，充分研磨过孔径180 μm的筛子后置于锥形瓶中，向其中加入200 mL乙腈-水（体积比1∶9）混合溶液，在摇床上室温混匀20 min。将混合液过滤并取10 mL滤液用PBS稀释至50 mL。将预先保存在4 °C的免疫亲和柱恢复到室温，取25 mL上述样液移至玻璃注射器筒中，将空气泵与注射器另一端相连调节下滴速度，控制液体以1~2 滴/s的速度流出，直至有空气进入柱内。弃置剩余液体后，向免疫亲和柱中加入2 mL甲醇洗脱，将洗脱液收集于离心管中用于测试分析。
在小麦、大米和玉米样品提取液中加入不同质量浓度（0.1、5、50、250和1 000 ng/mL）的DON标准溶液，按照本文“1.3 3）”所述的方法进行目标物检测。同时，所有样品均按照食品安全国家标准GB 5009.111─2016《 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》中HPLC-MS方法进行测定（n=3）。
由红外光谱图（
图3 傅里叶变换红外光谱图（A）、能量色散光谱图（B）、修饰前的光纤探针（C）和修饰完全抗原（BSA-DON）后的光纤探针（D）的原子力显微镜图
Fig.3 Fourier transform infrared spectrum （FT-IR） characterization diagram（A），energy dispersive spectroscopy diagram（B），atomic force microscope characterization diagram of the optical fiber probe without modification （C） and after BSA-DON modification （D）
光纤探针的稳定性对于评价该传感器的使用成本和检测效果至关重要。如
图4 不同时间下光纤探针的稳定性
Fig.4 Stability of fiber optic probe at different time
为了保证化学发光光纤免疫传感器达到最佳的检测效果，需要对试验中可能影响结果的参数进行优化。在光纤探针构建过程中，涉及探针表面DON-BSA的浓度优化，如
图5 完全抗原、呕吐毒素抗体和免疫反应时间对化学发光强度的影响
Fig.5 Effects of complete antigen，DON-antibody and immune response time on chemiluminescence intensity
A：完全抗原（BSA-DON）浓度优化；B：呕吐毒素抗体（DON-Ab）浓度优化；C：免疫反应时间优化.A：Optimized concentration of complete antigen （BSA-DON）； B：Optimized concentration of DON-antibody （DON-Ab）； C：Optimized immune response time.
考虑到实际检测过程中谷物样品中真菌毒素的多样性，化学发光光纤免疫传感器对DON的特异性检测是十分必要的。因此，引入了几种常见的真菌毒素AFB1、OTA、ZEN进行特异性反应，所有真菌毒素质量浓度均为1 μg/mL。从
图6 化学发光光纤免疫传感器检测DON的特异性（A）和抗干扰性能（B）
Fig.6 Specificity analysis （A） and anti-interference performance analysis （B） of chemiluminescent fiber optic immunosensor for DON detection
为进一步证明ΔCL信号是由化学发光光纤免疫传感器对DON的特异性识别产生，并且确保复杂环境对特异性检测的干扰极小，抗干扰实验将常见的真菌毒素（AFB1、OTA、ZEN）以及谷蛋白和葡萄糖分别作为干扰物与DON溶液进行混合，如
在最优条件下，通过化学发光光纤免疫传感器对检测DON的灵敏度进行了分析。根据竞争免疫原理，DON浓度与ΔCL呈正相关。
图7 化学发光光纤免疫传感器检测DON的标准曲线（A）和线性范围（B）
Fig.7 Standard curve （A） and linear range （B） of chemiluminescent fiber optic immunosensor for DON detection
ELISA法是一种广泛应用于谷物中DON检测的商业化方法，因此，采用ELISA法与化学发光光纤免疫传感器进行方法比对。如
图8 酶联免疫吸附法（ELISA）检测DON的标准曲线（A）和线性范围（B）
Fig 8 Standard curve （A） and linear range （B） of enzyme-linked immunosorbent assay for DON detection
3种谷物样品（小麦、玉米、大米）的加标回收结果和RSD测试结果见
本研究通过生物识别分子与光纤的固定化方法，采用共价结合策略实现了呕吐毒素完全抗原（DON-BSA）与光纤的稳定结合，研制了完全抗原功能化的光纤探针。以化学发光免疫分析为基础，使用固定完全抗原的光纤作为检测元件，以吖啶酯为化学发光底物，建立了一种DON现场快速检测的化学发光光纤免疫传感器，并通过一系列表征证明了固定方法的可行性，成功将其应用于谷物中DON的定量检测。与传统ELISA方法相比，该免疫传感器具有灵敏度高（62.7 pg/mL）、线性范围广（0.1~1 200 ng/mL）、检测效率高等优点，为基于酶的免疫传感分析策略提供了新的思路。
不同于常规免疫传感器，这种新型免疫传感器根据高灵敏和便携式两个特点将化学发光与光纤有效结合，集成化学发光和光纤传导等诸多优势，如：（1）信号读出方法采用化学发光，其特点在于痕量水平的反应即可获得高灵敏的信号；（2）光纤内芯作为生物识别分子的固定化载体，具有优异的导光性能和抗干扰能力；此外，光纤小巧的尺寸和仪器接口紧密结合的优势也很适合便携式检测，以此为基础搭建了一台体积小、成本低、操作简单的化学发光光纤传感平台，较适合应用于现场即时检测。
目前本方法和检测设备还存在一些缺陷，如光纤探针的商业化制备、设备无法同时对多根光纤探针同时进行检测等。在未来工作中，我们将在现有研究的基础上进一步创新，将这些新方法和新仪器朝向电器化、小型化、自动化的方向进一步发展，集生物学、物理学、化学于一体，推动现场快速检测技术在临床医学、食品安全、环境检测等方向的更多实用型研究。
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