摘要
为满足豇豆中极性农药的检测需求，在MCM-41介孔硅表面聚合二乙烯基苯（DVB）、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）和4-丙烯酰吗啉（ACMO），得到ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41材料；采用扫描电子显微镜、傅立叶变换红外光谱仪、热重分析仪、N2-物理吸附脱附等手段对材料进行了表征；以该材料制得固相微萃取萃取头，采用直接固相微萃取与气相色谱-氮磷检测器联用，建立了豇豆（Vigna unguiculata （L.） Walp.）中灭多威、克百威和灭蝇胺3种极性农药的检测方法。结果显示：在优化的条件下，3种农药的线性关系良好，决定系数均大于0.99，检出限为1.71~18.79 μg/kg，定量限为5.71~62.63 μg/kg。3种农药的加标回收率为84.4%~116.1%，相对标准偏差为2.2%~7.5%。结果表明，该方法具有较好的灵敏度、准确性和可靠性，可以满足国家规定豇豆中农药的最大残留限量检测。
豇豆（Vigna unguiculata （L.） Walp.）含有丰富的高品质植物蛋白、膳食纤维、维生素、矿物质等多种营养物
亲水亲脂平衡（hydrophilic-lipophilic balance，HLB）颗粒是一种具有高表面积特征的介孔聚合物，是由二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB）和N-乙烯基吡咯烷酮（N-vinylpyrrolidone，NVP）聚合而成，其中DVB作为疏水交联单体可以形成具有高内表面积的骨架吸附非极性化合物，NVP作为亲水单体可以增强与极性分析物的相互作
MCM-41是一类新型介孔硅材料，具有较强的热稳定性、较大的比表面积（700~1 500
灭多威、克百威和灭蝇胺在豇豆农药残留检测中经常出现检出或超标现
豇豆购买于湖北省武汉市洪山区狮子山街道农贸市场。甲醇、无水乙醇、甲苯、乙腈、无水硫酸钠均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；商用聚二甲基硅氧烷（PDMS）胶购自美国道康宁公司；DVB为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-VP、4-丙烯酰吗啉（ACMO）均为分析纯，购自上海麦克林生化科技有限公司；偶氮二异丁腈［2，2'-azobis（2-methylpropionitrile），AIBN］ 购自天津市光复精细化工研究所；waters Oasis HLB固相萃取小柱（3cc/60 mg，30 μm）购自杭州倍嘉仪器仪表商行。灭多威（methomyl，99.0%）、克百威（carbofuran，98.6%）、灭蝇胺（cyromazine，98.1%）购自上海农药所。试验用水为超纯水。
SP-7820型气相色谱仪（配置氮磷检测器，NPD），山东鲁南瑞虹化工有限公司；N2000色谱数据工作站，浙江大学智达信息工程有限公司；OV-1701毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.33 μm），兰州中科安泰分析科技有限公司；CT-1 A型氮氢空气发生器，武汉科林普丰仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，武汉德力祥仪器设备有限公司；真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；SU-8010型场发射扫描电子显微镜，天美科学仪器有限公司；IS50型傅立叶红外光谱仪，苏州奥普斯等离子体科技有限公司；TG209C型热分析仪，德国耐驰仪器制造有限公司；ASAP 2460型比表面与孔隙度分析仪，中国Agilent Technologies公司。商用聚丙烯酸酯萃取头（PA，85 μm），美国Supelco公司。实验室自制Oasis HLB萃取头（85 μm）参考文献［
气相色谱条件。以高纯氮气为载气，柱头压0.055 MPa，空气0.035 MPa，氢气0.030 MPa，尾吹气0.045 MPa，不分流。铷珠电流2.29 A。柱炉程序升温：初始温度160 ℃，以2 ℃/min升温至170 ℃，以10 ℃/min升温至280 ℃，保持5 min。进样口温度280 ℃，NPD检测器温度290 ℃。
1）MCM-41微球的制备。采用水热法合成MCM-41微球，具体步骤参考文献［
2）ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41材料的制备。向三口烧瓶中加入45 mL乙腈和15 mL甲苯（V︰V=3︰1）混合并用氮气吹扫30 min。将DVB、N-VP和ACMO按物质的量为3︰1︰0.83的比例加入到混合溶剂中，再加入15.00 mg AIBN作为引发剂同时加入0.60 g MCM-41微球。置于70 ℃油浴锅中通过热引发进行自由基聚合反应，并在600 r/min的条件下持续搅拌反应24 h。反应结束后抽滤，收集反应混合物。将该混合物用大量蒸馏水和乙醇洗涤后，在80 ℃下真空干燥24 h，即得ACMO-co-DVB-co-NVP @MCM-41材料。
不锈钢丝处理具体步骤参考文献［
用甲醇分别配制灭多威、克百威、灭蝇胺农药母液，质量浓度为20.00 mg/L，在-18 ℃冰箱保存备用。用甲醇稀释母液制得1.00 mg/g的混合标准溶液1用于不同萃取头萃取能力比较试验以及10.00 mg/g的混合标准溶液2用于萃取条件的优化试验。另外配制一系列浓度的混标用于线性范围和加标回收率测定。
试验前分别采用单一的农药标准品和混合标准品对分析物进行定性；试验过程中通过直接进样混合标准品和水中DI-SPME/GC-NPD确认分析物以及检查仪器的稳定性。
1）水中DI-SPME操作。取10 μL农药混标1加入装有9 mL超纯水的10 mL萃取瓶中，加入磁力搅拌子并封盖，将SPME装置的不锈钢管直接插入加标样品中，推出萃取头，在温度为40 ℃、转速为600 r/min的条件下萃取30 min，萃取完成后，将萃取头抽回不锈钢管内，用无尘纸小心拭去萃取头与钢管连接处的水滴，于280 ℃ GC进样口解吸10 min。所有试验平行操作3次，结果取平均值。
2）豇豆匀浆DI-SPME操作。按照豇豆︰超纯水=1︰1的质量比例打浆后装入锥形瓶，按每2 g豇豆匀浆添加10 µL农药混标的比例加标，于摇床振荡40 min混匀，在4 ℃冰箱中放置12 h后使用。取10 g豇豆匀浆于10 mL萃取瓶中，添加质量分数12.5%的无水Na2SO4，加入磁力搅拌子并封盖，将SPME装置的不锈钢管直接插入加标样品中，推出萃取头，在温度为90 ℃、转速为1 200 r/min的条件下萃取60 min。解吸前的快速漂洗和解吸后的清洗能够有效去除萃取头表面吸附的杂质而不会造成分析物的明显损
1）微观形貌。
图1 MCM-41微球（A）和ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41微球（B）的扫描电镜图
Fig.1 Scanning electron microscopy images of MCM-41 （A） and ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 （B） at 70 kx
2）结构组成。
图2 MCM-41微球以及ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41微球的红外光谱图
Fig.2 FT-IR spectra of MCM-41 microspheres and ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 microspheres
3）热稳定性。由
图3 ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41微球的热重分析图
Fig.3 Thermogravimetric analysis image of ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41 microspheres
4）N2-物理吸附脱附分析。由N2-物理吸附脱附测得，ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41材料的比表面积为605.26
为评价ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41萃取头的萃取能力，采用水中DI-SPME方法，选择自制Oasis HLB萃取头、ACMO-co-DVB-co-NVP萃取头、MCM-41萃取头和商用PA萃取头与该萃取头进行比较。以自制ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41萃取头对分析物的萃取峰面积为100%，另外4种萃取头的萃取峰面积进行相应计算（
注： logP：某物质在正辛烷（油）和水中的分配系数比值的对数值The logarithm of the ratio between the distribution coefficient of a substance in n-octane （oil） and water.
还比较了ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41萃取头和自制Oasis HLB萃取头的萃取覆盖能力，选取不同极性的分析物包括乐果（logP=1.32）、避蚊胺（logP=1.96）、甲苯（logP=2.68）、邻苯二甲酸二乙酯（logP=2.7）、多效唑（logP=2.99）、对二甲苯（logP=3.14）、邻苯二甲酸二戊酯（logP=5.89）、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（logP=8.71）等，结果表明ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41萃取头对这些物质的萃取效果优于Oasis HLB萃取头，萃取量为Oasis HLB萃取头萃取量的1.12~1.57倍。由此可见，ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41萃取头初步展现了宽的分析物覆盖能力和对极性物质的高萃取能力。
1）搅拌速度。从图4（DI-SPME条件：萃取时间，40 min；萃取温度，40 ℃；不加盐）可以看出，随着搅拌速度的增加，3种农药的萃取峰面积整体上呈增大趋势，在搅拌速率为1 200 r/min时的萃取峰面积最大。可能是搅拌速度增加加快了分子的运动，使萃取头在相同时间内可以接触更多的目标物，从而增加萃取头对农药的萃取量。
图4 搅拌速度对萃取量的影响
Fig.4 The effect of stirring rate on the extraction amounts
2）萃取温度。由图5（DI-SPME条件：萃取时间，40 min；搅拌速度，1 200 r/min；不加盐）可知，随着温度的升高，3种农药的萃取量均呈先增加后减少的趋势，灭多威和灭蝇胺的萃取量在90 ℃时达到最大值，克百威的最佳萃取温度为80 ℃。可能是萃取温度升高加快了目标物的扩散速率，有利于提高萃取能力和缩短萃取时间；但温度太高会减小目标物在涂层与基质之间的分配系数，降低萃取头的萃取效果。综合考虑，后续试验选择90 ℃萃取。
图5 萃取温度对萃取量的影响
Fig.5 The effect of extraction temperature on the extraction amounts
3）萃取时间。考察了30~70 min内，萃取时间对基质中目标物萃取量的影响。从图6（DI-SPME条件：萃取温度，90 ℃；搅拌速度，1 200 r/min；不加盐）可以看出，在萃取时间为30~60 min内3种目标物萃取量逐渐增加；在60~70 min内，随着萃取时间的增加，目标物的萃取量逐渐减少，可能是萃取时间太长导致前期被萃取头吸附的目标物又重新进入基质中，从而使萃取量减少。后续试验选择60 min作为最优萃取时间。
图6 萃取时间对萃取量的影响
Fig.6 The effect of extraction time on the extraction amounts
4）离子强度。如图7（DI-SPME条件：萃取时间，60 min；萃取温度，90 ℃；搅拌速度，1 200 r/min）所示，随着Na2SO4的增大，灭多威和克百威的萃取量逐渐增加；灭蝇胺的萃取量呈先增加后降低的趋势，在Na2SO4为12.5%时达到最大。加盐除了会使分析物发生盐析作用外，盐离子与分析物之间还会发生静电相互作用，当盐析作用大于静电作用时，物质的溶解度降低，会使萃取量增大；当静电作用大于盐析作用时，会增大物质的溶解度，从而降低萃取量。为了提高灵敏度，选择添加质量分数为12.5%的无水Na2SO4进行后续试验。
图7 加盐量对萃取量的影响
Fig.7 The effect of salt addition on the extraction amounts
采用外标法定量，以甲醇配制不同质量浓度的系列农药标准溶液，在优化的条件下，以加标浓度为横坐标、峰面积平均值为纵坐标，分别制作3种农药的定量标准曲线。如
注： y：峰面积；x：含量，mg/g；LOD=3δ/S，δ为样品空白响应值的标准偏差，S表示校正曲线的斜率；LOQ=LOD×10/3； 加标浓度分别为灭多威，5.00 μg/g；克百威，1.00 μg/g；灭蝇胺，5.00 μg/g.Note：y： Peak area； x： Concentration，mg/g；LOD=3δ/S，δ：Standard deviation of blank sample response value，S： The slope of correction curve； LOQ=LOD×10/3；Spiked concentration： methomyl，5.00 μg/g； carbofuran，1.00 μg/g； cyromazine，5.00 μg/g.
采用建立的DI-SPME/GC-NPD方法随机检测从农贸市场购买的豇豆中3种农药的含量。结果显示，该豇豆中灭多威、克百威和灭蝇胺均未检出。该萃取头性质稳定，在豇豆基质中使用60次以上萃取能力没有显著变化。
图8 DI-SPME/GC-NPD方法检测空白豇豆（a）和加标豇豆（b）中3种农药的色谱图
Fig.8 Chromatograms of DI-SPME/GC-NPD method for determination of 3 pesticides in blank cowpea pulp （a） and spiked cowpea pulp （b）
将本研究所建立的分析方法与已报道的测定农药的一些研究方法进行比较。如
注 Note：DSPE/HPLC-PDA：分散固相萃取/高效液相色谱法结合光电二极管阵列Dispersive solid-phase extraction/ high performance liquid chromatography coupled with photodiode array；QuPPe/DART-HRMS：快速极性农药提取/实时高分辨率质谱直接分析Quick polar pesticides extraction/direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry.
本研究合成了ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41新材料，使用直接粘合法制备了SPME涂层。该涂层性能稳定，在豇豆匀浆中使用60次后萃取能力无明显变化。通过不同萃取头萃取能力比较的结果表明，该萃取头对极性不同的分析物具有较好的萃取覆盖能力，而且对极性物质的萃取能力比HLB涂层更强。可能原因是涂层中MCM-41的引入增加了材料的比表面积从而增大了萃取量，ACMO增强了涂层的极性从而增强了对极性物质的吸附能力。该涂层可以扩大SPME方法的应用范围，在多组分和非目标物分析方面有很好的应用前景。后期还需要增加更多的极性和结构不同的物质对其萃取性能进行评价。
本研究应用ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41萃取头，采用DI-SPME法与GC-NPD联用，建立了豇豆中灭多威、克百威和灭蝇胺3种农药的检测方法。目前果蔬农药残留检测的前处理技术主要有固相微萃取、固相萃取、QuEChERS技术等。SPME的萃取原理是萃取头涂层对分析物的吸附作用。但由于萃取头材料性质的影响，限制了SPME技术在检测极性农药方面的应用。用于萃取弱极性和中等极性农药的涂层很多，但是能萃取灭蝇胺、灭多威等强极性农药的涂层很少。为了萃取这些强极性的农药，同时也能用于其他农药的分析，本研究制备了ACMO-co-DVB-co-NVP@MCM-41萃取头。本研究建立的方法应用所制备萃取头检测灭多威和灭蝇胺的检出限低于国家标准最大残留限量，可以满足豇豆样品分析检测的需要。克百威的极性较灭多威和灭蝇胺弱，SPME方法在其检测方面应用较多，本研究建立的方法对克百威的检出限虽低于国家标准最大残留限量，但高于某些文献的检出
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