摘要
为指导小白菜合理施用农药、降低农药残留水平，采用采样速率法对活体固相微萃取技术进行定量校正，结合气相色谱法对小白菜中3种农药（百菌清、毒死蜱和氟虫腈）进行了活体采样和定量测定，研究小白菜中农药的吸收、富集和消解行为。结果显示：活体检测方法准确、灵敏、快速、便捷；光照和温度均能促进3种农药降解；施药方式会影响农药的吸收，叶面喷洒施药后，小白菜对3种农药的吸收速率更快；培养方式会影响农药降解，土培方式的小白菜中农药消解速率比水培方式更快；采后贮藏对农药的降解也有一定影响，贮藏温度对于百菌清的消解速率影响不大，而低温能够延缓毒死蜱和氟虫腈的消解。结果表明，3种农药中百菌清的稳定性最差，氟虫腈在4 ℃条件下的稳定性最好，毒死蜱在常温和4 ℃条件下均比较稳定。
小白菜（Brassica chinensis L.）是一种在我国广泛种植的绿叶蔬菜，占长江中下游蔬菜种植面积的30%~40
农药残留分析通常包括样品制备和仪器测定2个步骤。其中，样品制备是一个关键步骤，它包括从样品中提取和富集目标物质，同时要尽量降低基质干扰。样品制备直接影响分析结果的准确性和精密度。传统的样品制备方法如固相萃取和液相萃取需要样品均质，然后进行萃取、分离和纯化，整个过程耗时且费力，并且需要大量的有机溶剂。最重要的是，这些样品制备方法对生物体是破坏性的，无法跟踪监测复杂生物体中残留物的动态变化，在采样过程中分析物可能还会损失或者发生形态变化。
近年来，研究者将目标转向了适合活体生物的样品预处理技术。活体固相微萃取（in vivo solid-phase microextraction， in vivo SPME）技
本研究以采样速率法进行定量校正，建立了活体固相微萃取-气相色谱方法（in vivo SPME/GC），并通过直接固相微萃取-气相色谱方法（direct immersion solid-phase microextraction/gas chromatography，DI-SPME/GC）进行对比验证，对小白菜中常用的3种农药（百菌清、毒死蜱和氟虫腈）进行准确定量，探讨不同环境因素对小白菜中3种农药消除动力学的影响，以及不同农药在小白菜可食用部位中的吸收、富集和消解，以期为植物活体中农药的跟踪监测及环境行为研究提供技术支持。
1）小白菜（Brassica chinensis L.）种子购自江苏宿迁景趣园艺店，种植在温度适宜、光照充足的室外盆装土壤中。将每株长有3~4片叶子的幼苗从盆中取出，转移到盛有营养土的种植箱中继续栽培，1~2周后开始喷洒农药，开展试验。
2）主要试剂。甲醇、丙酮、乙腈购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。试验用水均为超纯水。市售农药百菌清（75%可湿性粉剂）购自浙江威尔达化工有限公司，毒死蜱标准品（99%）和氟虫腈标准品（99%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
GC-8850型气相色谱仪器（电子捕获检测器，ECD），山东鲁南瑞虹化工有限公司；GC-8850系列气相色谱工作站，浙江大学智达信息工程有限公司；SE-54毛细管柱（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm），兰州中科安泰分析科技有限公司；CT-1型氮氢空气发生器，武汉科林普丰仪器有限公司；自制SPME手柄；58 μm甲基丙烯酸-二乙烯基苯-N-乙烯基吡咯烷酮介孔分子筛萃取头（methacrylic acid-divinylbenzene-N-vinyl pyrrolirodone@mesoporous molecular sieve，MAA-co-DVB-co-NVP@MCM-41）参考文献［
以高纯氮气为载气，流速1.0 mL/min，空气0.095 MPa，氢气0.065 MPa，尾吹气0.075 MPa，分流进样，分流比为4∶1，电流0.5 nA。柱温：初始温度100 ℃，以20 ℃/min升温至180 ℃，以10 ℃/min升温至240 ℃，5 ℃/min升至260 ℃，保持10 min，程序结束。进样口温度280 ℃，ECD检测器温度290 ℃。
1）小白菜施药。百菌清农药（75%可湿性粉剂）按照1∶4 000的比例兑水配制溶液，毒死蜱和氟虫腈使用标准品配制成质量浓度50 μg/mL的溶液，用于小白菜施药。每次施药从上下前后左右对小白菜表面进行喷洒，尽量均匀分布。
2）DI-SPME操作。准确称取一定量的小白菜，切段，按照料液质量比1∶3添加超纯水，用料理机打浆。在10 g小白菜匀浆中添加50 µL农药混标（百菌清0.5 mg/mL、毒死蜱1 mg/mL、氟虫腈1 mg/mL），磁力搅拌15 min混匀，4 ℃冰箱放置12 h。取10 g配好的加标匀浆分装至10 mL萃取瓶中，加入磁子，盖紧瓶盖。在1 200 r/min的搅拌速度下60 ℃萃取40 min。萃取完成后，取出萃取头于超纯水中快速漂洗5 s，然后于280 ℃的GC进样口解吸10 min，解吸完毕后以甲醇-丙酮（体积比1∶1）混合溶剂洗涤1 min，再使用无尘纸擦拭。将萃取头在280 ℃解吸5 min，继续分析下一个样品。
3）in vivo SPME操作。首先使用22规注射针头插入小白菜茎中约2 cm进行预打孔，拔出注射针后，将老化过的MAA-co-DVB-co-NVP@MCM-41萃取头插入预先打好的小孔中。萃取一段时间后，拔出萃取头，用密封垫堵住针头使其处于密封状态，置于装有冰块的保温装置中迅速返回实验室，转入-18 ℃冰箱存放，待进样前取出于超纯水中快速漂洗2 s，使用无尘纸轻轻蘸干萃取头表面残留的水滴，随后在290 ℃ GC进样口解吸10 min。解吸过后使用甲醇-丙酮（体积比1∶1）混合溶剂清洗1 min，并使用蘸有上述混合溶剂的无尘纸小心擦拭涂层表面，然后在280 ℃下老化5 min，即可进行下一次萃取。
4）采样速率校准法。根据采样速率
| （1） |
按照本文“1.3”，将配制好的100 mL农药混合溶液对2箱小白菜进行施药。施药后，分别放置在室外阳光直射处和室内阴凉通风处，在施药后2、6、12、24、36、48、60、72和96 h进行测定。每次取小白菜周围均匀分布的3个点同时采样，视为3个平行，采样时间为20 min，将活体采样后的萃取头带回实验室检测。分别求出小白菜在光照和无光照条件下的消解曲线和消解半衰期。小白菜中单一农药消解过程中的浓度采用一阶动力学方程计算，同时可得消解半衰期（t1/2
按照本文“1.3”方法，将配制好的100 mL农药混合溶液对3箱小白菜进行施药，分别放置在40、25和8 ℃下，于施药后2、6、12、24、32、36、48、60、72和96 h采样。
水培方式：试验前1 d，将小白菜植株从土壤中取出，用去离子水洗涤其根系，然后转移至添加了营养液的水中进行培养。24 h后，在营养液中加入农药混合溶液，培养液中每种农药质量浓度均为10 μg/mL，对照组小白菜在不加标但加营养液的水中培养，确保仅菜根与溶液接触。分别在小白菜暴露于加标溶液后的12、24、36、48和72 h测量植株茎中的农药质量浓度。暴露72 h后将植株转移到另一不加标但加营养液的溶液中进行降解试验，之后每隔12 h采用in vivo SPME/GC法跟踪测定茎中3种农药的浓度，直至试验结束。
土培方式：小白菜的试验步骤同本文“1.5”，常温下进行。对比2种培养方式小白菜对3种农药的吸收和降解情况。
将配制好的100 mL的农药混合溶液按照本文“1.3”的方法对小白菜进行施药，施药24 h后采摘并带回实验室，分别在常温（20 ℃）贮藏和低温（4 ℃）贮藏。在贮藏过程中的第12、24、36、48、72、96、120和168 小时进行原位固相微萃取采样，操作同in vivo SPME。采样后，萃取头立即插入GC进样口进行检测。
通过计算同一根萃取头在试验过程中反复萃取相同加标浓度的小白菜样品的峰面积，得到使用12、24、39、54、75次的萃取结果，如
图1 MAA-co-DVB-co-NVP@MCM-41萃取头在小白菜中的使用次数
Fig.1 The used times of MAA-co-DVB-co-NVP@MCM-41 fiber in pakchoi
由于SPME是一种非完全萃取技术，萃取涂层的容量远远小于样品体积，且采样时间短，从样品基质中萃取出分析物的量极少，采样后样品中目标分析物的浓度可以保持不变。因此，在活体SPME采样后再通过直接固相微萃取/气相色谱方法（DI-SPME/GC）测定植株中农药含量C0。根据采样速率
依据3倍信噪比计算in vivo SPME/GC方法的检出限（LOD），10倍信噪比计算定量限（LOQ
在监测过程中，同时采用in vivo SPME、DI-SPME 2种方法测定小白菜中农药含量。如
注： 不同字母代表不同处理组之间结果的显著性差异。下同。Note：Different letters represent significant differences of results between different treatment groups. The same as below.
图2 小白菜中3种农药残留的气相色谱图
Fig.2 GC chromatogram of 3 pesticides in pakchoi
C1：百菌清0.147 μg/g，毒死蜱0.324 μg/g，氟虫腈0.442 μg/g；C2：百菌清0.931 μg/g，毒死蜱0.575 μg/g，氟虫腈0.986 μg/g。 C1： Chlorothalonil 0.147 μg/g，chlorpyrifos 0.324 μg/g，fipronil 0.442 μg/g； C2：Chlorothalonil 0.931 μg/g，chlorpyrifos 0.575 μg/g， fipronil 0.986 μg/g.
图3 活体追踪室内（A）和室外光照下（B）小白菜中农药随时间的变化曲线
Fig.3 in vivo SPME tracing of pesticides in indoor （A） and outdoor （B） pakchoi
图4 活体追踪40 ℃（A）、25 ℃（B）和8 ℃（C）下小白菜中农药随时间变化曲线
Fig.4 in vivo SPME tracing of pesticides in pakchoi at 40 ℃ （A） ， 25 ℃ （B） and 8 ℃ （C）
由
图5 活体追踪土培（A）和水培（B）方式下小白菜中农药吸收消解曲线
Fig.5 in vivo SPME tracing of pesticides in pakchoi by soil culturing （A） and hydroponics （B）
由
图6 原位检测20 ℃（A）和4 ℃（B）下小白菜中农药随时间的变化曲线
Fig.6 in situ SPME tracing of pesticides in pakchoi at 20 ℃ （A） and 4 ℃ （B）
由
本研究建立了一种快速、准确、灵敏、非破坏性的in vivo SPME/GC方法，应用该方法对不同环境影响中的小白菜中3种农药进行监测，研究不同环境因素（温度、光照、种植方式）对小白菜中3种农药（百菌清、毒死蜱和氟虫腈）环境行为的影响。
光照和温度是影响小白菜生长期农药降解的关键因素。3种农药在强烈光照条件下的消解速率远远快于室内阴凉条件下，这可能是日晒过程中农药发生了热解和光解，农药分子在直接或间接吸收光能后，分子内的C—C、C—H、C—O和C—N等键会发生断裂并形成新的转化产物。也可能是不直接吸收光的辐射能量，而是借助其它物质作为载体，通过载体将光能转移给农药分子引起分子激发，或是载体自身发生反应产生中间体，然后中间体再与农药分子发生作
施加农药的方式会影响小白菜对农药的吸收和降解。叶面喷洒3种农药的吸收速率比根部施药更快，且叶面喷洒3种农药最高含量均高于水中施药的，原因可能在于叶面喷洒是将农药直接喷到植株表面，小白菜可以将表面农药直接吸收到茎叶中，而水中施加的农药从培养液转运到茎部和叶面需要一定时间，且蔬菜可以释放一些物质来加速农药在水溶液中的降
环境温度除了在采前影响植物中农药的消解，在采后贮藏中对农药降解也有一定影响。贮藏温度对于百菌清的消解速率影响不大，而低温能够延缓毒死蜱和氟虫腈的消解。原因在于，一方面，百菌清在植物体表上具有良好的黏着
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