摘要
为挖掘专一性壳聚糖酶，从多地土壤中筛选出1株高壳聚糖酶活力的真菌M3b，对其进行了形态学观察和18S rDNA序列鉴定，采用单因素试验和正交试验优化固体发酵工艺，研究纯酶的酶学性质。结果显示，菌株M3b为溜曲霉，其最佳产酶发酵条件为：以水为100%计，1%胶体壳聚糖+1%葡萄糖、0.5%硫酸铵、麸皮∶豆粕=6∶10、接种量为10 %、发酵6 d、初始发酵pH 7.0、发酵温度32 ℃。在此条件下酶活力达到20.56 U/mL，是初始发酵条件的221.3%。SDS-PAGE和酶谱分析发现该菌株只产1种壳聚糖酶，分子质量为40 ku。该酶的酶促反应最适pH值为5.5，最适温度为60 ℃，水解产物聚合度≥2。结果表明，采用溜曲霉进行固体发酵可以显著提高壳聚糖酶的酶活力，降低生产成本，纯化后的壳聚糖酶AtChito40酶学性质稳定，耐酸碱，且能有效地降解壳聚糖。
壳聚糖酶（chitosanase，EC 3.2.1.132）是一类催化壳聚糖中氨基葡萄糖间的β-1，4-糖苷键断裂，并水解释放壳寡糖的糖苷水解
溜曲霉与米曲霉有近缘关系，常用来处理农业纤维类废弃物，开发生物蛋白资源，具有较好的生物利用度和安全性。到目前为止，尚未见到溜曲霉产壳聚糖酶的相关报道。因此，本研究从多地土壤中分离出产壳聚糖酶活力较高的溜曲霉，采用固体发酵手段以提高壳聚糖酶的产量和活力。随后，对壳聚糖酶酶学性质进行研究，进一步验证壳聚糖酶的稳定性，以期为壳聚糖酶工业化生产和应用提供理论支撑。
微生物筛选自浙江、河南、湖北、海南、山东等省份的土壤；壳聚糖购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母浸粉购于安琪酵母股份有限公司；豆粕、麸皮购于武汉农贸市场；蛋白质Marker试剂盒购于Solarbio（中国北京）。
1）富集培养基。A液：胶体壳聚糖1%、pH 5.5~6.0；B液：KH2PO4 0.2%、酵母粉0.2%、无水MgSO4 0.1%、NaCl 1%、（NH4）2SO4 1%。
2）液体发酵培养基。A液：胶体壳聚糖溶液1%、pH 5.5~6.0；B液：KH2PO4 0.22%、Na2HPO4 0.1%、KCl 0.15%、MgSO4•7H2O 0.15%、CaCl2 0.02%、NH4Cl 0.5%、酵母浸粉0.3%。
3）初筛培养基。在液体发酵培养基的基础上添加2%琼脂。
4）固体发酵培养基。在液体发酵培养基的基础上添加：麸皮0.8%、豆粕0.8%；A液10 mL、B液20 mL。
称取土壤样品10 g，加90 mL无菌生理盐水，搅拌土壤悬浮液。吸取上层清液5 mL至50 mL富集培养基中，培养2 d。富集液进行1
取灭菌好的固体发酵培养基，加入10 mL灭菌营养液、20 mL 1%胶体壳聚糖和3 mL液体发酵液，37 ℃培养4 d。取培养好的固体曲，加入120 mL 0.2 moL/L醋酸缓冲液（pH 5.6），粉碎，4 ℃低速搅拌2 h。经多层纱布过滤，滤液于4 ℃下10 000 r/min离心10 min，收集上层清液为粗酶液，4 ℃冰箱内保存。
肉眼观察菌株的菌落形态、颜色等。采用插片法培养真菌，乳酸石炭酸棉蓝染料染色15 min制片，显微镜下观察，进行初步鉴定。菌株送到生工生物工程（上海）股份有限公司进行18S rDNA序列测序，结合NCBI数据库建立系统发育树，进行菌株鉴定。
根据张馨月
酶活力单位定义：在上述条件下，每毫升粗酶液每分钟产生1 μmoL还原糖（以氨基葡萄糖计算）所需的酶量为1个酶活力单位（U）。相对酶活力是以同组试验的最高酶活力为100%，其他酶活力与最高酶活力的比
按照Brad-ford法，以牛血清白蛋白作为标准蛋白样品，测定蛋白质含量。
除了豆粕和麸皮、酵母浸粉，分别采用不同碳源：1%胶体壳聚糖+1%葡萄糖、1%胶体壳聚糖+1%蔗糖、1%胶体壳聚糖+1%淀粉、1%胶体壳聚糖、1%粉末壳聚糖、1%胶体几丁质、1%粉末几丁质、1%葡萄糖、1%蔗糖、1%淀粉，考察碳源对菌株发酵产酶的影响。
在最佳碳源下分别添加相同质量的不同氮源（NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、蛋白胨和牛肉膏），不同比例的麸皮和豆粕（14∶2、12∶4、10∶6、8∶8、6∶10、4∶12、2∶14），不同接种量的液体发酵液（1、2、3、4、5 mL），按照不同发酵时间（3、4、5、6、7 d），设置不同起始pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），不同温度（27、32、37、42、47 ℃），分别研究各因素对菌株产壳聚糖酶活力的影响，以确定各单因素的最佳参数。在单因素试验基础上，选取固体发酵的温度、时间、起始pH，设计三因素三水平的L9（
将发酵浸提的粗酶液缓慢搅拌加入干燥的硫酸铵固体粉末，达到80%的饱和度，冰水浴30 min，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，收集沉
采用12%分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝G-250染色观察目标蛋白质，并使用蛋白质Marked试剂盒（Solarbio，中国北京）分析该壳聚糖酶的分子质量。酶谱分析参照本实验室之前的研
蛋白进行SDS-PAGE后采用电喷雾-四级杆-飞行时间串联质谱（ESI-Q-TOF2）鉴定蛋白质肽段序
采用乙酸-乙酸钠（pH 3.0~6.0）、NaH2PO4-Na2HPO4（pH 6.0~7.5）、Tris-HCl（pH 7.5~9.0）、甘氨酸-氢氧化钠（pH 9.0~10.0）缓冲液体系（50 mmol/L）溶解底物，将纯酶液适当稀释，测定壳聚糖酶活力，以壳聚糖酶活力最大值为100%，确定最适反应pH。考察酶的pH稳定性，将壳聚糖酶在pH 3.0~10.0处理30 min，在标准条件下测定剩余酶活力。在最适pH下，不同温度（30~90 ℃）测定酶活力，以最大壳聚糖酶活力值为100%，分别计算各温度下的相对酶
壳聚糖酶与1%胶体壳聚糖在50 ℃下搅拌8 h进行水解反应，不同时间点取样，煮沸20 min后灭活，12 000 r/min离心10 min，取上层清液，经0.22 μm滤膜过滤。采用用薄层层析法（TLC）分析壳聚糖酶液的降解产
通过富集培养，利用胶体壳聚糖作为唯一碳源筛选和分离产壳聚糖酶的菌株，分别测量透明圈和菌落的直径，计算两者的比值，初步判定菌株降解能力大小，测定结果见
菌株M3b菌落形态和透明圈大小如
图1 M3b菌株的菌落特征（A）和孢子结构的油镜图（100 ✕）（B）
Fig. 1 The colony characteristics（A） and oil immersion lens picture of spore structure（100 ✕） of M3b（B）
菌株M3b测序结果显示18S rDNA序列长度为1 298 bp，通过GenBank数据库的序列比对，构建系统发育进化树（
图2 基于18S rDNA序列的系统发育进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree based on 18S rDNA sequences of selected strains
由
图3 碳源（A）、氮源（B）、麸皮豆粕质量比（C）、接种量（D）、起始pH（E）、发酵温度（F）对溜曲霉M3b产壳聚糖酶的影响
Fig.3 Effect of carbon sources （A），nitrogen sources （B），bran soybean meal ratio（C），inoculation amount （D），
图A中1为胶体壳聚糖，2为粉末壳聚糖，3为胶体几丁质，4为粉末几丁质，5为胶体壳聚糖+葡萄糖，6为胶体壳聚糖+蔗糖，7为胶体壳聚糖+可溶性淀粉，8为葡萄糖，9为蔗糖，10为可溶性淀粉。In Fig. A，1：Colloidal chitosan；2：Powder chitosan； 3：Colloidal chitin； 4：Powder chitin； 5：Colloidal chitosan glucose； 6：Sucrose； 7：Colloidal chitosan soluble starch； 8：Glucose； 9 ：Sucrose； 10：Soluble starch.
pH （E），and temperature （F） on chitosanase production by Aspergillus tamarii M3b
如
在最佳碳氮源的基础上，改变麸皮豆粕的质量比，结果如
接种不同量的液体发酵液培养发酵，结果如
由
如
固体发酵时间对溜曲霉M3b产壳聚糖酶的影响见
图4 培养时间对溜曲霉M3b产壳聚糖酶的影响
Fig. 4 Effect of fermentation time on chitosanaseproduction by Aspergillus tamarii M3b
正交试验结果发现，发酵时间对于酶活力的影响最大，其次是发酵温度、起始pH。最优组合为发酵温度32 ℃、起始pH 7.0、发酵时间6 d，此条件下进行发酵，产酶活力达到20.56 U/mL，是初始固体发酵培养的221.3%。
固体发酵培养基经缓冲液浸提的粗酶液，经硫酸铵沉淀、QSFF阴离子交换层析纯化后得到电泳单一带。
图5 溜曲霉M3b菌株产壳聚糖酶纯化的SDS-PAGE电泳图谱
Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis of chitosanase purified from Aspergillus tamarii M3b strain
M：170 Marker； 1：固体发酵粗酶液； 2：硫酸铵沉淀； 3：纯酶液； 4：壳聚糖酶酶谱。M ：170 Marker； 1：Solid fermentation crude enzyme solution； 2：Ammonium sulfate precipitation； 3：Purified AtChito40； 4：Enzymogram of chitosanase.
蛋白纯化结果（
在NCBI数据库中3个肽段分别都存在同源性为100%的壳聚糖酶肽段。肽段MDVDCDG与Aspergillus nidulans FGSC A4 （gi 259480859）、Aspergillus niger （gi 966763517）及Penicillium digitatum Pd1（gi 953382223）壳聚糖酶对应的氨基酸残基肽段序列同源性为100%。而肽段EVTGEASWLMAR与Aspergillus nidulans FGSC A4（gi 259480859）、Aspergillus fumigatus Af293（gi 146223521）以及Microcystis aeruginosa（gi 754187083）来源的壳聚糖酶肽段序列同源性为100%。肽段EVTGEASWLMAR则与Penicillium oxalicum 114-2（gi 146323521）、Aspergillus nidulans FGSC A4（gi 259480859）和Aspergillus fumigatus Af293（gi 146323521）等来源的壳聚糖酶氨基酸残基肽段序列同源性达100%。结合以上的纯化过程和结果，可以证明该蛋白为壳聚糖酶。值得注意的是，质谱显示的其他众多片段在数据库中与其他蛋白质序列比对的同源性较低，表明AtChito40可能较为新颖。
菌株M3b产壳聚糖酶的最适温度结果见
图6 不同温度（A）和pH（B）对壳聚糖酶AtChito40活力和稳定性的影响
Fig.6 Effect of temperature （A） and pH （B） on activity and stability of AtChito40
如
以胶体壳聚糖为底物， 测定了壳聚糖酶AtChito40的水解产物及特性。 如
图7 溜曲霉M3b产壳聚糖酶水解胶体壳聚糖产物的TLC分析
Fig.7 TLC analysis of hydrolysis products from colloidal chitosan hydrolyzed by chitosanaseproduction by Aspergillus tamarii M3b
壳聚糖酶是高效、特异降解壳聚糖的酶，利用酶法降解壳聚糖的研究还处在实验室研究阶段，仅少数实现工业化生产，高产壳聚糖酶菌株的缺乏是制约壳寡糖规模化生产的瓶颈。本研究成功筛选出1株产壳聚糖酶活力较高的溜曲霉菌株M3b，从单因素试验结果可见，溜曲霉菌株M3b壳聚糖酶的产生需要壳聚糖诱导并且粉末壳聚糖对菌株M3b产壳聚糖酶的诱导作用低于胶体壳聚糖；在以壳聚糖为碳源的基础上添加少量葡萄糖要优于以胶体壳聚糖为唯一碳源，可能与葡萄糖利于菌株M3b的生长代谢有关；同时几丁质也有一定的诱导能力；仅添加淀粉、葡萄糖或者蔗糖，菌株M3b不产壳聚糖酶。这与冯志彬
本研究在单因素试验基础上，对固体发酵的温度、时间、起始pH进行了优化，结果显示，最优组合为发酵温度32 ℃、起始pH 7.0、发酵时间6 d，在此条件下M3b产壳聚糖酶水平达到20.56 U/mL。这与采用固体发酵产壳聚糖酶鹿皮曲霉（8.26 U/mL
不同菌株产壳聚糖酶的最适温度不同。本研究中菌株M3b产壳聚糖酶的最适温度为60 ℃。一般来说，真菌壳聚糖酶的最适温度在50~55 ℃，Fusarium solani最适温度为40 ℃，Penicilliumi slandicum最适温度为45 ℃，Aspergillus oryzae IAM2660最适温度为50
参考文献References
PANG Y，YANG J，CHEN X，et al. An antifungal chitosanase from Bacillus subtilis Sh21［J］. Molecules，2021，26（7）：1-14. [百度学术]
KANG B R，SONG Y S，JUNG W J.Differential expression of bio-active metabolites produced by chitosan polymers-based Bacillus amyloliquefaciens fermentation［J/OL］.Carbohydrate polymers，2021，260：117799［2022-04-07］.https：//doi.org/10.1016/j.carbpol.2021.117799. [百度学术]
GUO N，SUN J N，WANG W，et al.Cloning，expression and characterization of a novel chitosanase from Streptomyces albolongus ATCC 27414［J］.Food chemistry，2019，286：696-702. [百度学术]
张馨月，岳晓洁，李铮峥，等.淡紫紫孢菌的筛选、鉴定及产壳聚糖酶固体发酵条件优化［J］.中国食品学报，2020，20（4）：160-169.ZHANG X Y，YUE X J，LI Z Z，et al.Isolation and identification of Purpureocillium lilacinum and optimization of its solid fermentation conditions for producing chitosanase［J］.Journal of Chinese institute of food science and technology，2020，20（4）：160-169（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
李佳茵，王慧敏，祖国仁.海洋真菌MF-08产壳聚糖酶诱导条件及酶学性质分析［J］.湖北农业科学，2016，55（7）：1778-1781.LI J Y，WANG H M，ZU G R.Study on the inducing conditions and enzyme characteristics of a strain marine fungal MF-08 producing chitosanase［J］.Hubei agricultural sciences，2016，55（7）：1778-1781（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
曹永强，余志坚，陈超，等.一株嗜热链球菌乳糖酶的分离纯化及酶学特性研究［J］.食品科学技术学报，2018，36（2）：42-51.CAO Y Q，YU Z J，CHEN C，et al.Isolation，purification and enzyme characteristics of lactase produced by a Streptococcus thermophiles strain［J］.Journal of food science and technology，2018，36（2）：42-51（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
FU X，GUO Y X，JIN Y G，et al.Bioconversion of chitin waste using a cold-adapted chitinase to produce chitin oligosaccharides［J/OL］.LWT，2020，133：109863［2022-04-07］.https：//doi.org/10.1016/j.lwt.2020.109863. [百度学术]
JIANG Z Q，MAּ S A，GUAN LY，et al.Biochemical characterization of a novel bifunctional chitosanase from Paenibacillus barengoltzii for chitooligosaccharide production［J/OL］.World journal of microbiology and biotechnology，2021，37（5）：1-13［2022-04-07］.https：//doi.org/10.1007/s11274-021-03051-0 83. [百度学术]
DOAN C T，TRAN T N，NGUYEN V B，et al.Production of a thermostable chitosanase from shrimp heads via Paenibacillus mucilaginosus TKU032 conversion and its application in the preparation of bioactive chitosan oligosaccharides［J/OL］.Marine drugs，2019，17（4）：217［2022-04-07］.https：//doi.org/10.3390/md17040217. [百度学术]
DING M，ZHANG T，SUN C，et al.A Chitosanase mutant from Streptomyces sp.N174 prefers to produce functional chitopentasaccharide［J］.International journal of biological macromolecules，2020，151：1091-1098. [百度学术]
EMBABY A M，MELIKA R R，HUSSEIN A，et al.Biosynthesis of chitosan-oligosaccharides （COS） by non-aflatoxigenic Aspergillus sp.strain EGY1 DSM 101520：a robust biotechnological approach［J］.Process biochemistry，2018，64：16-30. [百度学术]
冯志彬，薛钰，陈国忠，等.1株产壳聚糖酶细菌的分离、鉴定和发酵条件优化［J］.食品科学，2016，37（19）：171-176.FENG Z B，XUE Y，CHEN G Z，et al.Isolation，identification of Bacillus mojavensis amy P216 and optimization of its fermentation conditions for enhanced chitosanase production［J］.Food science，2016，37（19）：171-176（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
ZHANG H，ZHANG W.Induction and optimization of chitosanase production by Aspergillus fumigatus YT-1 using response surface methodology［J］.Chemical & biochemical engineering quarterly，2013，27（3）：335-345. [百度学术]
章晔敏，邵一凡，熊妍妍，等.响应面法优化鹿皮曲霉ZJOU-AC1产壳聚糖酶的发酵条件［J］.中国酿造，2016，35（11）：93-98.ZHANG Y M，SHAO Y F，XIONG Y Y，et al.Optimization of fermentation conditions of chitosanase-producing Aspergillus cervinus ZJOU-AC1 by response surface methodology［J］.China brewing，2016，35（11）：93-98（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
DA SILVA L C A，HONORATO T L，CAVALCANTE R S，et al.Effect of pH and temperature on enzyme activity of chitosanase produced under solid stated fermentation by Trichoderma spp.［J］.Indian journal of microbiology，2012，52（1）：60-65. [百度学术]
龚香艺，吴静，邬敏辰.真菌壳聚糖酶研究进展［J］.食品科学，2012，38（17）：308-311.GONG X Y，WU J，WU M C.Research progress of fungal chitosanase［J］.Food science，2012，38（17）：308-311（in Chinese with English abstract）. [百度学术]
ZHOU W，YUAN H，WANG J，et al.Production，purification and characterization of chitosanase produced by Gongronella sp.JG［J］.Letters in applied microbiology，2008，46（1）：49-54. [百度学术]
ZHANG H，SANG Q，ZHANG W H.Statistical optimization of chitosanase production by Aspergillus sp.QD-2 in submerged fermentation［J］.Annals of microbiology，2012，62（1）：193-201. [百度学术]
CHEN X，XIA W，YU X. Purification and characterization of two types of chitosanase from Aspergillus sp. CJ22-326［J］. Food research international，2005，38（3）：315-322. [百度学术]
WANG S L，YU H T，TSAI M H，et al. Conversion of squid pens to chitosanases and dye adsorbents via Bacillus cereus［J］. Research on chemical intermediates，2018，44（8）：4903-4911. [百度学术]