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广陈皮中黄酮类化合物提取物对t-BHP诱导HepG2细胞氧化损伤保护作用机制  PDF

  • 陶叶杏 ✉
  • 余倩
  • 刘瑞婷
  • 张曦文
  • 吴婷
  • 潘思轶
  • 徐晓云 ✉
华中农业大学食品科学技术学院/环境食品学教育部重点实验室/ 果蔬加工与品质调控湖北省重点实验室，武汉 430070

中图分类号： R285.5

最近更新：2022-10-11

DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2022.05.020

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EN 引
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摘要

为了研究陈化对于广陈皮抗氧化活性的影响，以新鲜干燥果皮、贮藏1 a和10 a广陈皮（Pericarpium Citri Reticulatae ‘Chachi’，PCR-C）为研究对象，提取纯化得到广陈皮黄酮类化合物提取物（PCR-CF），以叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导HepG2 细胞作为氧化应激损伤模型，评价陈皮的抗氧化活性，同时利用qRT-PCR和Western blot技术进一步探究其抗氧化活性作用分子机制。结果显示，广陈皮陈化过程中，橙皮苷含量呈现波动，但总体上是下降趋势；而多甲氧基黄酮及其总含量呈增加趋势，其中PCR-C10F中含量最高，PMFs总含量达到（98.66±0.56） mg/g。而且，不同贮藏年份PCR-CF可明显提高SOD、GSH水平和降低MDA含量，且不同年份间差异显著，PCR-C10F抗氧化活性最强，SOD、GSH、MDA水平分别达到（139.38±17.38） U/mg和（117.81±3.22） μmol/g、（0.39±0.03） nmol/mg。相关性分析表明，川陈皮素的积累是PCR-C10F维持氧化还原平衡的主要活性成分。此外，PCR-C10F显著上调Nrf2 mRNA以及其在胞核蛋白中的表达；从而激活抗氧化酶的mRNA和蛋白表达水平，HO-1的mRNA表达水平和蛋白表达水平显著降低。研究表明，陈皮在陈化过程中，多甲氧基黄酮含量呈现增加趋势，抗氧化活性不断增强，PCR-C10F能够通过调控Nrf2-ARE抗氧化信号通路起到氧化应激抵御保护作用。

广陈皮（Pericarpium Citri Reticulatae ‘Chachi’，PCR-C）来源于茶枝柑（Citri reticulata ‘Chachi’）的干燥成熟果皮，主要产于广东省江门市新会区［

1］。研究表明，PCR-C具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗哮喘、神经保护作用等生物活性［2-3］。黄酮类化合物是PCR-C中的主要活性成分，主要包括橙皮苷、川陈皮素、橘皮素等糖苷黄酮类化合物和多甲氧基黄酮类化合物［4］。而且，黄酮类化合物的动态变化对PCR-C质量和活性的影响尚不清楚。

氧化应激与人类多种慢性疾病的发生和发展密切相关［

5］。黄酮类化合物表现出较强的抗氧化生物活性，可以作为一种间接抗氧化剂，通过调控细胞内相关抗氧化酶的表达来激活体内的抗氧化机制，从而维持机体氧化还原稳态［6］。调控细胞内源性抗氧化系统的一系列抗氧化酶和解毒酶主要包括醌氧化还原酶1（NQO1）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、谷胱甘肽S-转移酶-Ω1（GSTO1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）以及血红素加氧酶-1（HO-1），在氧化应激损伤下，能够清除体内多余的活性氧，从而在维持细胞内氧化还原稳态方面发挥着重要作用［7］。而Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）是一种核因子E2相关因子2，这些抗氧化酶的表达由Nrf2进行调控。当Nrf2被激活后，Nrf2与Keap1蛋白发生解离，从细胞质转移至细胞核内，与细胞核内的抗氧化反应元件 ARE进行结合，从而诱导下游抗氧化酶的表达，发挥维持机体内氧化还原稳态的作用［8］。黄酮类化合物可通过Nrf2-ARE抗氧化信号通路发挥抗氧化活性，成为一种潜在的Nrf2激活剂［9］。橘皮素能够有效抑制叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导的HepG2 细胞中ROS 水平的升高，减弱氧化应激损伤对 GSH 的消耗，通过促进Nrf2入核激活下游抗氧化酶 HO-1 和 NQO1 的表达，增强细胞内抗氧化系统，发挥抗氧化活性［10］。

本研究以新鲜干燥果皮以及贮藏1、10 a的广陈皮为研究对象，分析广陈皮在陈化过程中黄酮类化合物的含量变化；以t-BHP诱导氧化应激损伤的人肝癌细胞HepG2细胞为模型，探究PCR-CF的抗氧化活性作用，并通过qRT-PCR和Western blot技术研究PCR-C10F的抗氧化作用分子机制，旨在探究广陈皮在陈化过程中黄酮类化合物含量变化与抗氧化活性的相关性，为陈皮的品质控制及合理使用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

人肝癌细胞（human hepatoma cell，HepG2 cell）购买于中科院上海细胞库干细胞库。新鲜果皮、贮藏1 a和10 a的PCR-C药材，购自广东省江门市新会区双水镇柑泽园，样品经湖北中医药大学药学院鉴定。MEM培养基购于美国Gibco公司；胎牛血清购于南乌拉圭Quacell公司；色谱级的乙腈购于美国Fisher公司；色谱级的甲酸购于天津市科密欧化学试剂有限公司；BCA法蛋白测定试剂盒（BCA02）购于北京鼎国昌盛科技有限公司；GSH（A006-2-1）、MDA（A003-4-1）、T-SOD（A001-1-2）试剂盒购于南京建成生物科技有限公司；RNApure 超纯总RNA快速提取试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司；荧光定量 PCR 所用引物合成，购于北京擎科生物科技公司；TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 荧光定量试剂盒和TaKaRa Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒（RR047A），均购于宝生物工程（大连）有限公司；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（P0028）；小鼠单抗β-actin（BM0627）、HRP标记羊抗小鼠二抗（BA1051）、HRP标记羊抗兔二抗（BA1054）均购于武汉博士德生物工程有限公司；兔多抗Nrf2（A0674）购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；兔多抗HO-1（10701-1-AP）购于武汉三鹰生物技术有限公司；兔多抗NQO1（DF6437）购于美国Affinity Biosciences公司；兔多抗SOD1（PA5-27240）购于美国Invitrogen公司；兔单抗GSTO1（ab138491）和兔多抗GSH-Px（ab22604）购于Abcam公司；小鼠单抗Histone H3（bsm-33042M）购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 主要仪器设备

超声破碎仪，VCX750，美国索尼克斯；全波长酶标仪，MULTISKAN GO，美国Thermo公司；高效液相色谱仪，e2695，美国Waters公司；微量核酸测定仪，NanoDrop2000，美国 NanoDrop Technologies 公司；电泳仪，DYY-8C，北京六一仪器厂；凝胶成像系统，Gel Doc XR+，美国LI-COR公司；荧光定量PCR仪，Qtower2.2，德国 Analytik JenaAG公司；垂直电泳槽，DYCZ-24DN，北京六一仪器厂；电转仪，DYCZ-40，北京六一仪器厂。

1.3 试验方法

1）HepG2细胞的培养。细胞培养于含10%胎牛血清、1%双抗及 MEM 基础培养基中，置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中，待其长至瓶壁的80%左右，用胰蛋白酶消化传代，每隔3~4 d传代1次。

2）广陈皮中黄酮类化合物的提取纯化。参照笔者所在实验室前期研究方法［

11］，用80%乙醇超声辅助提取，料液比1︰20（g/mL），超声辅助提取30 min，超声频率40 kHz，功率480 W，提取温度25 ℃。用HPD300树脂进行纯化富集，最后冷冻干燥得到PCR-CF。

3）HPLC分析。参照笔者所在实验室前期研究方法［

11］，使用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）作为流动相，梯度洗脱条件为15%~25% B （0~5 min），25%~35% B （5~20 min），35%~45% B （20~40 min），45%~75% B （40~45 min），75%~85% B （45~50 min），85%~15% B （50~55 min），保持15% B 持续5 min。色谱柱温度为25 °C，流速为1 mL/min，进样量为20 μL，设定280、330 nm波长进行检测。

4）SOD、GSH、MDA水平的测定。参照笔者所在实验室前期研究方法［

11］，将生长状态良好、处于对数生长期的HepG2细胞按照5×105个/mL接种于6孔板中，过夜，待细胞贴壁生长。向样品组和样品对照组加入50 μg/mL PCR-CF样品，设置空白对照组和模型组，加入基础培养基，药物作用24 h后，模型组及样品组均加入300 μmol/L t-BHP刺激诱导细胞3 h。待细胞处理结束后，收集细胞超声破碎取上清，按SOD、GSH、MDA试剂盒说明书进行操作测定各个指标，并按照BCA蛋白试剂盒测定蛋白含量。

5）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达水平。将生长状态良好、处于对数生长期的HepG2细胞按照6×105个/mL浓度接种于12孔板中，过夜，待细胞贴壁生长。向样品组和样品对照组加入50 μg/mL PCR-C10F样品，设置空白对照组和模型组，加入基础培养基，药物作用24 h后，模型组及样品组均加入300 μmol/L t-BHP刺激诱导细胞3 h。待细胞处理结束后，采用RNA pure 超纯总RNA快速提取试剂盒进行RNA的提取，使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒对RNA进行反转录，使用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 荧光定量试剂盒进行qRT-PCR分析。以GAPDH为内参，采用2⁃⁃ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。所用引物如表1所示。

表1  引物序列信息
Table 1  Primers sequence
基因Gene序列（5′-3′） Primers

Reference

参考文献

GAPDH F: GGAGTCAACGGATTTGGT [12]
R: GTGATGGGATTTCCATTG
Nrf2 F: CTTGGCCTCAGTGATTCTGAAGTG [12]
R: CCTGAGATGGTGACAAGGGTTCTA
HO-1 F: ATGGCCTCCCTGTACCACATC [12]
R: TGTTGCGCTCAATCTCCTCCT
NQO1 F: GGATTGGACCGAGCTGGAA [12]
R: AATTGCAGTGAAGATGAAGGCAAC
GSTO1 F: AGGACGCGTCTAGTCCTGAA [12]
R: TTCCCTGGGTATGCTTCATC
SOD1 F: GGTGGGCCAAAGGATGAAGAG [13]
R: CCACAAGCCAAACGACTTCC
GSH-Px F: CAGTCGGTGTATGCCTTCTCG [13]
R: GAGGGACGCCACATTCTCG

6）蛋白免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达。细胞的处理与分组与RNA提取的细胞处理方式一致。用加入了蛋白酶抑制剂（PMSF）的RIPA细胞裂解液进行细胞总蛋白的提取。按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒的方法得到细胞核蛋白。4 ℃、10 000 r/min，离心5 min，取上清并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。根据目标蛋白分子质量大小选择分离胶的浓度，先恒压80 V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，再改为恒压120 V至溴酚蓝到凝胶底部，约需90 min。电泳结束后进行转膜，5% 脱脂奶粉的TBST中封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL显影并进行拍照。

7）数据统计与分析。试验至少有3个独立的平行试验，数据结果以平均值±标准偏差（Mean ± SD）表示。采用IBM SPSS Statistic Version 25.0统计软件分析数据，多组间比较采用单因素ANOVA方差分析，P<0.05时认为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 PCR-CF中主要黄酮类化合物的含量变化

PCR-CF中主要黄酮类化合物含量如图1所示［

12］，新鲜陈皮中，橙皮苷含量最高，其他主要黄酮类化合物如：异橙黄酮、甜橙黄酮、5，7，8，4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮、橘皮素以及多甲氧基黄酮（PMFs）的总含量在贮藏10 a的陈皮中含量较高。

图1  PCR-CF中主要黄酮类化合物的含量

Fig.1  The contents of main flavonoids in PCR-CF

1.橙皮苷Hesperidin；2.异橙黄酮Isosinensetin；3.甜橙黄酮Sinensetin；4.5，7，8，4'-四甲氧基黄酮5，7，8，4'-Tetramethoxyflavone；5.川陈皮素Nobiletin；6.3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮3，5，6，7，8，3'，4'-Heptamethoxyflavone；7.橘皮素Tangeretin；8.PMFs.

2.2 PCR-CF对t-BHP诱导的HepG2细胞氧化损伤的影响

细胞内SOD、GSH和MDA水平可以反映抗氧化活性水平。如表2所示，与模型组相比，Fresh-F和PCR-C10F均能显著提高HepG2细胞中SOD和GSH的活力（P<0.05），特别地，PCR-C10F水平显著高于Fresh-F（P<0.05）；此外，Fresh-F、PCR-C01F 和PCR-C10F均能显著降低t-BHP诱导的细胞内MDA水平（P<0.05），其中，PCR-C10F的MDA水平显著低于Fresh-F和PCR-C01F（P<0.05）。结果表明，在t-BHP诱导的HepG2细胞氧化损伤作用下，PCR-CF能够有效改善细胞氧化应激损伤，从而发挥抗氧化作用，而且PCR-C10F抗氧化活性较强。

表2  PCR-CF对t-BHP诱导的HepG2细胞中SOD、GSH、MDA水平的影响
Table 2  Effect of PCR-CF on t-BHP-induced the levels of SOD，GSH and MDA in HepG2 cells
组别 GroupSOD/(U/mg)GSH/ (μmol/g)MDA/ (nmol/mg)
对照Control 154.64±10.23a 116.39±2.85a 0.32±0.09a
Model 101.88±6.40d 56.26±3.40c 1.14±0.13c
Fresh-F 123.76±12.13c 95.32±8.55b 0.54±0.08b
PCR-C01F 106.98±6.84d 94.10±4.07b 0.65±0.04b
PCR-C10F 139.38±17.38b 117.81±3.22a 0.39±0.03a

注   Note：同列字母不同代表差异显著（P<0.05）。Different letters in the same column represent significant differences （P<0.05）.

PCR-CF中所含的黄酮类化合物可能是其发挥抗氧化活性的关键成分，为了进一步探究黄酮类化合物与抗氧化活性之间是否具有相关性，对PCR-CF中黄酮类化合物的含量与SOD、GSH和MDA水平进行Pearson相关性分析（表3），总PMFs含量与SOD、GSH水平呈现显著正相关（R2=0.845、0.934，P<0.01），与MDA水平呈现显著负相关（R2=-0.903，P<0.01）。在所分析的黄酮类化合物中，只有川陈皮素含量不仅与SOD、GSH水平呈现显著正相关（R2=0.934、0.861，P<0.01），而且与MDA水平呈现显著负相关（R2=-0.918，P<0.01）。结果表明，川陈皮素可能是PCR-CF减轻t-BHP诱导的HepG2细胞氧化损伤的关键活性成分。

表3  PCR-CF中黄酮类化合物的含量与SOD、GSH和MDA水平相关性分析
Table 3  Pearson correlation analysis between the content of flavonoids and the levels of SOD，GSH and MDA in PCR-CF
因素 VariableSODGSHMDA
橙皮苷 Hesperidin 0.647 0.205 -0.425
异橙黄酮 Isosinensetin 0.558 0.117 -0.35
甜橙黄酮 Sinensetin 0.887** 0.576 -0.736*
5,7,8,4'-四甲氧基黄酮 5,7,8,4'-Tetramethoxyflavone 0.828** 0.495 -0.681*
川陈皮素 Nobiletin 0.934** 0.861** -0.918**
3,5,6,7,8,3'，4'-七甲氧基黄酮 3,5,6,7,8,3',4'-Heptamethoxyflavone 0.867** 0.598 -0.765*
橘皮素 Tangeretin 0.226 0.656 -0.439
PMFs 0.845** 0.934** -0.903**

注   Note：*相关性在0.05水平上显著（双尾）。**相关性在0.01水平上显著（双尾）。*Correlation is significant at the 0.05 level （two-tailed）. ** Correlation is significant at the 0.01 level （two-tailed）.

2.3 PCR-C10F对Nrf2 基因mRNA表达的影响

PCR-C10F抗氧化活性较强，为了进一步探究PCR-C10F对t-BHP诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用机制，使用qRT-PCR考察了PCR-C10F对氧化应激状态下Nrf2基因水平的影响。如图2所示，与模型组相比，在PCR-C10F药物干预作用下，细胞内Nrf2基因 mRNA的表达水平极显著上调（P<0.001）。结果表明，PCR-C10F能够通过上调Nrf2基因 mRNA的表达，从而有效减轻t-BHP诱导的HepG2细胞氧化损伤。

图2  PCR-C10F对t-BHP诱导HepG2细胞Nrf2 mRNA表达的影响

Fig.2  Effect of PCR-C10F on mRNA expression of Nrf2 in HepG2 cells induced by t-BHP

GADPH作为内参基因。结果以平均值±标准差表示，n=3。*，P<0.05，**，P<0.01，***，P<0.001，下同。GADPH was used as the reference gene. Results were presented as mean ± SD，n=3. *，P< 0.05，** ，P< 0.01，*** ，P< 0.001. The same as below.

2.4 PCR-C10F对Nrf2蛋白转移入核的影响

为了进一步确定PCR-C10F能否促进细胞内Nrf2转移入核，测定Nrf2 蛋白的表达情况。如图3A，B所示，与模型组相比，在PCR-C10F药物干预作用下，Nrf2在胞核蛋白中的表达水平显著增加（P<0.05）。图3A，C表明，在PCR-C10F药物干预作用下，Nrf2在总蛋白中的表达水平显著增加（P<0.05）。如图3D所示，与模型组相比，在PCR-C10F药物干预作用下，Nrf2入核率显著增加（P<0.05）。因此，以上结果表明，在t-BHP诱导HepG2细胞氧化损伤作用下，PCR-C10F能够促进HepG2细胞中Nrf2从细胞质转移至细胞核，从而促使Nrf2发挥其转录因子的作用。

图3  PCR-C10F对t-BHP诱导HepG2细胞Nrf2 蛋白表达的影响

Fig.3  Effect of PCR-C10F on protein levels of Nrf2 in HepG2 cells induced by t-BHP

A：分别提取总蛋白和胞核蛋白，通过Western blot 技术测定HepG2 细胞中 Nrf2 蛋白表达情况，Histone H3作为胞核蛋白内参，β-actin作为总蛋白内参The total protein and nuclear protein were extracted to measure the expression level of Nrf2 protein in HepG2 cells via Western blot. Histone H3 was used as the reference protein for nuclear protein and β-actin was used as the reference protein for total protein. B~D分别为Nrf2蛋白在胞核蛋白、总蛋白以及两者之比中表达水平的统计分析结果。结果以平均值±标准差表示，n=3。The statistical analysis results of the expression levels of Nrf2 protein in nucleus protein，total protein and the ratio of nucleus Nrf2 to total Nrf2. Results were presented as mean ± SD，n=3.

2.5 PCR-C10F对抗氧化酶mRNA的影响

测定细胞内NQO1、 GSTO1、SOD1、GSH-Px、HO-1基因的mRNA表达水平，探究PCR-C10F能否通过促进Nrf2入核上调细胞内抗氧化相关基因的表达。如图4A~E所示，与模型组相比，在PCR-C10F药物干预作用下，NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px基因的mRNA表达水平极显著上调（P<0.001），HO-1基因的mRNA表达水平极显著降低（P<0.001）。以上结果表明，在t-BHP诱导HepG2细胞氧化损伤的作用下，PCR-C10F能够通过上调Nrf2-ARE抗氧化信号通路下游多种抗氧化酶基因（NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px）的表达，下调应激反应蛋白（HO-1）的基因表达，维持细胞氧化/抗氧化动态平衡状态。

图4  PCR-C10F对t-BHP诱导HepG2细胞中NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px和HO-1 mRNA表达水平的影响

Fig.4  Effect of PCR-C10F on mRNA expression of NQO1，GSTO1，SOD1，GSH-Px and HO-1 in HepG2 cells induced by t-BHP

提取分离细胞总RNA后，通过qRT-PCR技术测定HepG2 细胞中NQO1（A）、SOD1（B）、GSTO1（C）、GSH-Px（D）、HO-1（E） 基因mRNA表达水平。GADPH作为内参基因，结果以平均值±标准差表示，n=3。The total RNA were extracted to measure mRNA expression of NQO1 （A），SOD1 （B），GSTO1 （C），GSH-Px （D） and HO-1 （E） in HepG2 cells via qRT-PCR. GADPH was used as the reference gene.Results were presented as mean ± SD，n=3.

2.6 PCR-C10F对抗氧化酶和应激反应蛋白的影响

进一步分析t-BHP刺激诱导下HepG2细胞中NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px抗氧化酶蛋白和HO-1 应激反应蛋白的表达情况，结果如图5所示，与模型组相比，在PCR-C10F药物干预作用下，NQO1和SOD1蛋白表达水平极显著升高（P<0.01），GSTO1和GSH-Px蛋白表达水平极显著升高（P<0.001），HO-1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。因此，以上结果表明，在t-BHP诱导HepG2细胞氧化损伤的作用下，PCR-C10F能够在基因和蛋白水平通过上调Nrf2-ARE抗氧化信号通路下游多种抗氧化酶（NQO1、GSTO1、SOD1和GSH-Px）的表达，下调应激反应蛋白（HO-1）的表达，从而维持细胞氧化/抗氧化动态平衡状态，增强细胞在氧化应激损伤下的抗氧化防御能力。

图5  PCR-C10F对t-BHP诱导HepG2细胞中NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px和HO-1 蛋白表达水平的影响

Fig.5  Effect of PCR-C10F on protein levels of NQO1，GSTO1，SOD1，GSH-Px and HO-1 in HepG2 cells induced by t-BHP

A：提取细胞中总蛋白，通过Western blot技术测定HepG2 细胞中NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px、HO-1蛋白的表达水平，β-actin作为内参The total protein were extracted to measure the expression levels of NQO1，GSTO1，SOD1，GSH-Px and HO-1 protein in HepG2 cells via western blot. β-actin was used as the reference protein for total protein； B~F分别为NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px、HO-1 蛋白表达水平的统计分析结果，结果以平均值±标准差表示，n=3。The statistical analysis results of the expression levels of NQO1，GSTO1，SOD1，GSH-Px and HO-1 protein. Results were presented as mean ± SD，n=3.

3 讨论

黄酮类化合物是陈皮发挥生物活性的重要物质基础，中国药典以橙皮苷含量作为陈皮质量评价指标，“陈久者良”在陈皮使用和市场定价中被广泛认同，然而橙皮苷含量变化与陈皮的陈化年限并不一致［

14-15］。本研究结果也表明，不同贮藏年份的陈皮中橙皮苷的含量呈现波动状态，其中贮藏10 a的陈皮中橙皮苷的含量较新鲜果皮显著降低，提示需要引入更多的黄酮类化合物作为评价指标。本研究显示异橙黄酮、甜橙黄酮、5，7，8，4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮、橘皮素以及总PMFs，在陈化过程中虽然呈现波动状态，但PCR-C10F中的含量最高，整体上表现出增加的趋势。这与Liang等 ［15］提出的陈皮在陈化过程中，橙皮苷含量降低，橘皮素、川陈皮素等多甲氧基黄酮类化合物含量呈现增加的趋势相一致，多甲氧基黄酮类化合物的含量增加可能是陈皮在陈化过程中活性变化的重要影响因素。

t-BHP是一种氧化损伤诱导剂，可以与细胞膜上的脂质、蛋白质等生物大分子反应引起氧化损伤［

16］。因此，选择t-BHP诱导的HepG2细胞氧化损伤模型探究PCR-CF的抗氧化活性，结果表明，PCR-CF可通过提高SOD活性和GSH含量，减少t-BHP诱导产生的过量MDA，发挥抗氧化活性作用；而且在陈化的过程中，呈现增强的趋势，其中以PCR-C10F的氧化应激保护作用最显著。

在正常生理状态下，Nrf2与Keap1以二聚体的形式定位于细胞质中；而一旦受到外界刺激，Nrf2就会与Keap1发生解离，从细胞质转移进至细胞核中，并与ARE作用，激活下游一系列抗氧化酶的表达［

17］。本研究表明，在PCR-C10F干预下，Nrf2转录因子的表达在基因和蛋白水平上均显著上调，而且能够促进Nrf2转移入核，增加其在细胞核中的累积，从而提高细胞的抗氧化防御能力。研究表明，陈皮的多甲氧基黄酮类成分提取物能够通过激活Nrf2信号通路来发挥抗氧化活性作用［18］，这与本研究结果一致。此外，PCR-C10F使细胞保护蛋白NQO1、GSTO1、SOD1以及GSH-Px在基因和蛋白水平均显著增加，并下调HO-1的表达。与本研究结果一致的是，甜橙皮水提取物以及其主要成分橙皮苷、橘皮素和川陈皮素［19］可通过上调t-BHP诱导的HepG2细胞中GSH-Px和CAT的表达来抵御氧化应激损伤。而且，研究表明当HepG2细胞暴露于氧化剂的氧化应激损伤下，HO-1的mRNA水平和蛋白表达水平均上调［20］，黄酮类化合物可以减弱氧化剂诱导的HO-1的表达水平［21］。由此可见，PCR-C10F通过促进Nrf2转移入核，激活Nrf2-ARE抗氧化信号通路下游NQO1、SOD1、GSTO1和GSH-Px 4种抗氧化酶mRNA和蛋白的表达，下调应激反应蛋白HO-1的表达，减轻细胞的氧化应激损伤，发挥抗氧化活性。

综上所述，陈皮在陈化过程中多甲氧基黄酮类化合物含量呈现增加的趋势，而且其抗氧化活性也随之增强，而且川陈皮素的积累可能是主要的因素。PCR-C10F表现出较强的抗氧化活性，能够通过调控Nrf2-ARE抗氧化通路下游抗氧化酶mRNA和蛋白的表达减轻t-BHP对HepG2细胞的氧化应激损伤，从而发挥抗氧化活性，为陈皮发挥间接抗氧化活性作用机制的研究提供了理论基础，进而为陈皮的合理贮藏及使用提供一定的理论依据。本研究由于只选取了同一产地同一果园的样本，而且不同年份的样本量有限，还需进一步扩充样品的品种来源及年份深入开展研究。

参考文献References

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