摘要
为探究硫酸软骨素N-乙酰半乳糖胺基转移酶-1（chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase-1，CSGalNAcT-1）在克氏原螯虾免疫反应中的作用，利用RACE技术成功获得克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因完整cDNA序列，并通过荧光定量PCR分析该基因在各组织中的表达模式以及在CpG寡脱氧核苷酸（ODN）、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒（WSSV）刺激后的表达情况。结果显示，克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因在中肠的相对表达量最高，其次是近胃段肠，在心脏、胃、肌肉和围食道神经中的相对表达量较低。克氏原螯虾肝胰腺、血细胞中CSGalNAcT-1基因表达量在嗜水气单胞菌和WSSV刺激下呈现出下调及上调，而在注射免疫刺激剂CpG ODN后，CSGalNAcT-1基因表达水平在大部分组织中呈现上调。表明克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因可能在抵御外界病原侵染以及增强自身免疫反应的过程中发挥重要作用。
硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS） 作为一种天然的酸性粘多糖，参与多种生理过程的调控，在细胞黏附、形态发生、神经网络形成和细胞分裂方面能够发挥特定的生物学功
试验用克氏原螯虾采集于湖北省潜江市某人工养殖基地，体质量15~25 g，暂养于室内的塑料盒中，水温控制在25~28 ℃，充氧，投喂小龙虾人工配合饲料，每天早晚各1次。选取健康活力强的克氏原螯虾个体120尾，均分为4组，养殖在4个塑料盒中至少7 d以适应试验环境。试验期间每天投喂1次。
另采集3尾健康虾的中肠、近胃段肠、卵巢、鳃、后肠、食道下神经节、脑、腹部腹神经索、胸部腹神经索、皮下组织、血细胞、肝胰脏、输精管、促雄性腺、眼柄、心脏、胃、肌肉和围食道神经节等19个组织的样品，迅速置于液氮速冻，存放于-80 ℃冰箱备用。
取肠道组织进行研磨，采用TRIzol Reagent（Thermo Scientific，USA）法根据说明书进行总RNA的提取。使用紫外分光光度计（Thermo Scientific，USA）检测其质量与浓度。使用ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific，USA）根据说明书进行反转录以获得cDNA第一链。
基于NCBI中已知无脊椎动物的CSGalNAcT-1基因序列的保守区域，设计简并引物（CSG-J-F/R），采用PCR扩增获得克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因的cDNA部分片段（
根据获得的CSGalNAcT-1基因的部分cDNA序列来设计5' RACE引物（B695-1（GSP1）、B695-2（GSP2）、 B695-3（GSP3））和3' RACE引物（C468-1、 C468-2）（
克氏原螯虾19个组织样品采用本文材料与方法“1.2”中的方法获得cDNA第一链。在 QuantStudio Realtime Lightcycler仪器上进行荧光定量PCR（qRT-PCR），采用20 µL qRT-PCR体系：TB Green Premix ExTaq Ⅱ（TaKaRa，China）10 µL，正/反向引物（CSG-q-F/R）各0.2 µL（10 µmol/L），cDNA模板1 µL，ddH2O 8.6 µL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性 5 min，然后 95 ℃ 30 s，最适温度（64.5 ℃）30 s，72 ℃ 30 s，循环40次。管家基因18s-RNA用作内参基因，并在相同的条件下进行扩增。每个样品设置3个重复，并通过熔解曲线以及比较阈值（Ct）法来确定PCR反应的特异性。
1） 不同刺激物刺激实验。向3个试验组的克氏原螯虾个体分别注射免疫增强剂CpG ODN、WSSV和嗜水气单胞菌，对照组克氏原螯虾个体注射生理盐水。注射实验所用的ODN由擎科生物科技有限公司合成，直接用蒸馏水稀释后使用，质量浓度为0.5 mg/mL；WSSV浓度为9.7×1
2） 不同刺激物刺激后CSGalNAcT-1基因在克氏原螯虾各组织中的表达检测。在注射后6、12、24、48、96 h，每组分别取3尾虾，取其肝胰腺、鳃、皮肤、胃、肌肉、肠道组织放置于冻存管内，迅速置于液氮冷冻后放入-80 ℃冰箱保存。使用装有抗凝剂的1 mL注射器从虾体的围心腔内采集血液，4 000 r/min 4 ℃离心15 min，去上清液，保留血细胞，并迅速置于液氮中冷冻后放入-80 ℃冰箱保存。按照本文材料与方法“1.2”所述方法进行总RNA的提取、cDNA模板的合成，以及采用荧光定量PCR检测克氏原螯虾受到不同刺激物刺激后CSGalNAcT-1基因在各组织中的表达变化情况。
利用DNAMAN软件将3'末端和5'末端序列与已获得的中间序列进行拼接、验证，得到CSGalNAcT-1基因的cDNA序列全长。利用NCBI中的BLASTX与BLASTP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线搜索工具对该基因的cDNA序列进行比对；使用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）在线软件预测CSGalNAcT-1基因序列的开放阅读框；利用SignalP5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测CSGalNAcT-1基因编码氨基酸的信号肽；利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam）及SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）分别预测氨基酸的理化性质和保守结构域。使用DNAMAN软件中多序列比对方法，对不同鱼类的CSGalNAcT-1氨基酸序列进行同源性分析；使用MEGA 5.1软件中邻接法（neighbor-joining）对不同鱼类CSGalNAcT-1氨基酸序列进行系统发育分析，构建克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因系统发育树，自展值设为1 000。
采用
通过RACE技术获得了克氏原螯虾1 956 bp 的CSGalNAcT-1基因序列全长（GenBank登录号：MT311699）。该基因序列包含1个长为1 608 bp的开放阅读框（ORF），1个长度为104 bp的5'非翻译区（UTR）和1个长度为244 bp的3'非翻译区；共编码535个氨基酸，预测分子质量为60 186.46 u，理论等电点为6.73，不存在跨膜位点（
图1 CSGalNAcT-1的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of CSGalNAcT-1
“［］”内为信号肽；DXD基序序列以加粗字体标出；β4GalT基序序列用方框标出；起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA）以箭头指出；阴影部分为CHGN保守结构域；Glyco_transf_7C保守结构域以下划线标出。The signal peptide region is in square bracket.DXD motifs are written in bold.The β4Gal-T motif is boxed.The start code and stop code are indicated by arrowheads.The shadow indicates the CHGN conserved domain.The Glyco_transf_7C conserved domain is underlined.
图2 CSGalNAcT-1的多重氨基酸序列比对（A）以及系统发育树（B）
Fig.2 Multiple amino acid sequence alignment of CSGalNAcT-1（A） and the neighbor-joining tree constructed（B）
CSGalNAcT-1基因在克氏原螯虾各组织中的表达分析结果显示，在各个组织中都能够广泛检测到CSGalNAcT-1表达。其中，在中肠（MG）中CSGalNAcT-1的表达量最高，其次是近胃段肠（FG）、卵巢（Ov）、鳃（Gi）和后肠（HG）。而CSGalNAcT-1在食道下神经节（SG）的表达量比较低；在脑（Br）、腹部腹神经索（VG）、胸部腹神经索（TG）、皮下组织（Hy）、血细胞（Hem）、肝胰脏（Hep）和输精管（TD）的表达量更低；在促雄性腺（AG）、眼柄（Es）、心脏（Hea）、胃（St）、肌肉（Mu）和围食道神经节（PN）等组织，CSGalNAcT-1几乎没有表达（
图3 克氏原螯虾CSGalNAcT⁃1基因在各组织中的表达情况
Fig.3 The expression profile of CSGalNAcT⁃1 in different tissues of Procambarus clarkii
MG：中肠 Midgut；FG：近胃段肠 Foregut；Ov：卵巢 Ovary；Gi：鳃 Gill；HG：后肠 Hindgut；SG：食道下神经节 Subesophageal ganglia；Br：脑 Brain；VG：腹部腹神经索 Ventral ganglia；TG：胸部腹神经索 Thoracic ganglia；Hy：皮下组织 Hypodermis；Hem：血细胞 Hemocytes；Hep：肝胰脏 Hepatopancreas；TD：输精管 Testicular ducts；AG：促雄性腺 Androgenic gland；Es：眼柄 Eyestalk；Hea：心脏 Heart；St：胃 Stomach；Mu：肌肉 Muscle；PN：围食道神经节 Periesophageal nerve.
检测克氏原螯虾在不同刺激物刺激后CSGalNAcT-1基因的表达变化如
图4 不同刺激物刺激后克氏原螯虾CSGalNAcT⁃1基因在不同时间点不同组织中的表达情况
Fig.4 Expression levels of CSGalNAcT⁃1 after different pathogen infection in different tissues at different time
A：肝胰脏Hepatopancreas；B：鳃Gill；C：表皮Cuticular epidermis；D：胃Stomach；E：肌肉 Muscle；F：肠道 Intestine；G：血细胞 Haemocytes；*表示显著性差异（P<0.05），**表示极显著性差异（P<0.01）。An asterisk represents the significant difference（P<0.05），and two asterisks represent the extremely significant difference（P<0.01）.
本研究克隆获得了克氏原螯虾CSGalNAcT-1基因全长序列，通过生物信息学分析发现氨基酸序列含有DXD和GWGGED 2个基序序列，这与之前研究中对于CSGalNAcT-1的描述一
CS在各组织和细胞中都能够广泛合成，CSGalNAcT-1基因同样在各组织中都有广泛表达。CSGalNAcT-1在CS的合成过程中发挥重要作
与其他甲壳类动物一样，克氏原螯虾不具备获得性免疫，完全依赖先天性免疫来抵抗外界病原入
WSSV病毒侵染会使得克氏原螯虾肠道稳态遭到破坏并导致疾病的发
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