首页 > 过刊浏览>2022年第41卷第6期 >201-207. DOI:10.13300/j.cnki.hnlkxb.2022.06.023
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斑马鱼ddx27基因对tp53基因的调控作用
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作者:
作者单位:

1.上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室/;上海海洋大学国家水生动物病原库，上海 201306;2.密歇根州立大学农业和自然资源学院，美国，密歇根，东兰辛 48824

作者简介:

陈改拓，E-mail：cgt501684720@163.com

通讯作者:

张庆华，E-mail：qhzhang@shou.edu.cn

中图分类号:

S857.4

基金项目:

国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”专项（ 2019YFD0900102） ； 教育部留学回国人员科研启动基金（D-8002-15-0042）；水产动物疾病与基因编辑育种的平台建设和前沿科学研究（A1-3201-19-3013）


Regulation of tp53 gene by ddx27 in zebrafish （Danio rerio）
Author:
Affiliation:

1.Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，Shanghai Ocean University/National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals， Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;2.College of Agriculture and Natural Resources，Michigan State University，East Lansing 48824，USA

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    摘要:

    为探究斑马鱼ddx27基因对tp53基因表达的影响，根据NCBI网站在线数据库中分析得到的ddx27基因编码序列（coding sequence，CDS），利用同源重组技术构建斑马鱼ddx27真核表达载体pCMV-3×Flag-ddx27。通过亚细胞定位试验和蛋白质免疫印迹技术验证ddx27基因的表达，并利用双荧光素酶试验验证ddx27基因的过表达对tp53基因转录活性的影响。结果显示，ddx27 CDS区及阳性克隆的电泳片段大小以及测序比对均与预期结果一致。蛋白质免疫印迹显示Ddx27重组质粒可正常表达，且蛋白大小与预测结果一致。亚细胞定位显示Ddx27蛋白表达于HEK293T细胞的细胞核中。而且，过表达pCMV-3×Flag-ddx27真核表达载体能够显著增强 tp53启动子报告基因载体pGL3-tp53-Luc的活性，为对照组的1.8倍（P<0.05）。以上结果表明，斑马鱼pCMV-3×Flag-ddx27真核表达载体构建成功，能够在哺乳动物的细胞核中表达，且ddx27基因可以促进tp53基因的表达。

    Abstract:

    The aim of this study was to investigate the regulatory effect of ddx27 gene on tp53 gene expression in zebrafish （Danio rerio） .The zebrafish ddx27 eukaryotic expression vector pCMV-3×Flag-ddx27 was constructed using homologous recombination technology based on the coding sequence （CDS） of ddx27 gene from NCBI online database.Sub-cellular localization and Western blotting were used to confirm the expression of ddx27 gene，the effect of ddx27 gene overexpression on tp53 gene expression was tested using dual-luciferase reporter gene assay.The results showed that the electrophoretic fragment size and sequencing alignment of ddx27 CDS region and positive clones were consistent with expectations.Western blotting showed that Ddx27 recombinant plasmid could be expressed normally，and the protein size was consistent with the predicted results.Sub-cellular localization showed that Ddx27 protein was expressed in the nucleus of HEK293T cells.Furthermore，the pCMV-3×Flag-ddx27 vector could significantly enhance the activity of tp53 promoter reporter gene pGL3-tp53-Luc，which was 1.8 times than that of the control group （P<0.05）.The above results showed that the zebrafish pCMV-3×Flag-ddx27 eukaryotic expression vector was successfully constructed and could be expressed in the mammalian nucleus，and ddx27 gene could promote the expression of tp53 gene.

    图1 斑马鱼Ddx27系统进化树构建Fig.1 Phylogenetic tree construction of zebrafish Ddx27
    图2 ddx27基因CDS区序列克隆与真核表达载体构建验证Fig.2 Sequence cloning of CDS region of ddx27 gene and validation of eukaryotic expression vector construction
    图3 Ddx27蛋白Western blot检测结果Fig.3 Western blot results of Ddx27 protein
    图4 pCMV-3×Flag-ddx27在HEK293T细胞中的定位Fig.4 Localization of pCMV-3×Flag-ddx27 in HEK293T cells
    图5 斑马鱼ddx27对tp53转录活性的影响Fig.5 Effect of zebrafish ddx27 on the transcriptional activity of tp53
    表 2 双荧光素酶试验转染复合物配比Table 2 Dual-luciferase assay transfection complex proportion
    表 1 构建ddx27重组质粒所用引物以及酶切位点的选择Table 1 Primers required for the construction of ddx27 recombinant plasmid and selection of enzyme digestion sites
    参考文献
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陈改拓,周志杰,周泽斌,包林珠,邱军强,李伟明,张庆华.斑马鱼ddx27基因对tp53基因的调控作用[J].华中农业大学学报,2022,41(6):201-207

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  • 收稿日期:2022-04-27
  • 在线发布日期: 2022-12-09
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