Page 86 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2024年第1期
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               面临着培育高产、抵御生物和非生物胁迫品种的挑                           rRNA 基因高通量测序。
               战 ［16］ 。利用微生物来缓解干旱胁迫对作物产生的不                      1.5 总DNA提取及16S rRNA基因序列扩增
               利影响将会是一种新的途径。然而，对于干旱胁迫                               样品总基因组 DNA 提取根据 PowerSoil DNA
               下马铃薯内生细菌群落组成结构的研究鲜有报道。 分离试剂盒（MO BIO Laboratories）操作流程进行。
               因此，研究干旱胁迫下马铃薯叶片内生细菌的多样                           选 用 通 用 引 物 338F（5'-ACTCCTACGGGAG⁃
               性和组成，可以为内生细菌途径改善马铃薯对干旱                           GCAGCAG-3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGT⁃
               胁迫的耐受性提供参考和依据。                                   WTCTAAT-3'）扩增 16S rRNA V3~V4 区，PCR 扩
                                                                增和后续分析在 Illumina Novaseq 测序平台上进行。
               1 材料与方法
                                                                1.6 序列处理与分析
               1.1 供试马铃薯品种                                          微生物多样性是基于 Illumina Novaseq 测序平
                   丽薯 6 号，由云南省会泽县农技中心提供，为耐                      台，利用双末端测序（paired-end）的方法，构建小片段
               旱中间型品种      ［17-18］ 。                            文库进行测序。通过对 Reads 拼接过滤，聚类或去
               1.2 马铃薯的种植及管理                                    噪，根据 2021 年 42 个原核生物门级别拉丁名称的重
                   本研究采用温室盆栽法，土壤为云南农业大学                         要修订  ［22］ ，进行物种注释（相似性≥97%）及丰度分
               后山试验田的红壤土，盆栽所用塑料花盆高 23 cm， 析，可以揭示样品的物种构成；进一步进行 α 多样性
               外径 30 cm，底部有孔，装土前在花盆底部铺合适大                       分析（alpha diversity）、β 多样性分析（beta diversity）、
               小的纱布，以防土壤从底部的孔流失和害虫进入土                           显著物种差异分析，评估干旱胁迫对马铃薯叶片内
               壤内对根系造成危害。将花盆内的土浇水至土壤饱                           生细菌的群落结构和多样性的影响，采用 SPSS 24.0
               和含水量，即开始播种。选取发育良好、芽体饱满、 软件进行方差分析。
               大小基本一致、具有 1个顶芽种薯薯块种植在塑料盆                         2 结果与分析
               内，每盆定植 1 株，每个处理 3 次重复，播种前将马铃
               薯种薯表面用无菌水冲洗干净，用 1% 的次氯酸钠溶                        2.1 测序结果及OTUs丰度
               液消毒 10 min，70% 的乙醇浸泡 30 s 后立刻除去乙                     由表 1可见，正常浇水处理下马铃薯叶片种群共
               醇，无菌水冲洗 5 次，避光晒干后播种              ［19］ 。播种在土      获得 438 081 条有效 tags，聚类获得 1 548 个 OTUs，
               层约7 cm深处，出苗后10 d进行胁迫处理。                          共注释到细菌 26 门 62 纲 157 目 273 科 553 属 611 种；
               1.3 干旱胁迫处理                                       干旱处理下马铃薯叶片种群共获得 397 772 条有效
                   以土壤水分占最大持水量的 75%~80% 为正常                     tags，聚类获得 2 006个 OTUs，共注释到细菌 30门 72
               浇 水 对 照 组（CK），以 土 壤 水 分 占 最 大 持 水 量 的            纲 181 目 340 科 653 属 730 种。由此可知，正常浇水
                                            ［20］
               40%~45% 为干旱胁迫处理（D）              。在种植前，用          处理下马铃薯叶片种群获得的 OTU 数量少于干旱
               环刀法测定土壤最大持水量，种植过程中每隔 2 d 用                       处理下马铃薯叶片种群，注释到的叶片内生细菌种
               土壤水分温度测定仪（Takeme-10）监测土壤水分，并                     属少于干旱处理下马铃薯叶片种群。
               根据土壤最大持水量及时补充水分。                                 2.2 物种丰度及群落组成结构
               1.4 样品采集与预处理                                         由图 1 可见，在门分类水平上，正常浇水处理下
                   马铃薯块茎形成期进行取样，取健康马铃薯植                         与干旱处理下马铃薯叶片内生细菌丰度前 10的细菌
               株顶叶下完全展开的第4片复叶。                                  菌主要是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Fir⁃
                   将采集的样品用流水冲洗 1~2 h，无菌滤纸擦干                     micutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Acti⁃
               样品表面的水分，然后用无菌水漂洗 3 次，75% 乙                       nobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、蓝细菌门（Cy⁃
               醇浸泡 1 min，无菌水漂洗 3 次，3% NaClO 溶液浸                 anobacteria）、绿 弯 菌 门（Chloroflexi）、芽 单 胞 菌 门
               泡 1 min，无菌水漂洗 3 次，75% 乙醇中浸泡 30 s，无 （Gemmatimonadetes）、Epsilonbacteraeota 和螺旋菌门
               菌水漂洗 3次     ［21］ 。吸取最后 1次漂洗液涂布于 LB和 （Spirochaetes）。其中，正常浇水处理下马铃薯叶片内
               PDA 平板上作为空白对照，与其他平板相同条件培                         生 细 菌 种 群 相 对 丰 度 由 高 到 低 排 序 为 变 形 菌 门
               养，验证表面消毒是否彻底。将处理合格的叶片样 （75.75%）>厚壁菌门（12.45%）>拟杆菌门（3.73%）>
               品 送 往 北 京 百 迈 客 生 物 科 技 有 限 公 司 进 行 16S          放线菌门（2.36%）>酸杆菌门（1.69%）>蓝细菌门
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