Page 50 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第6期
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44                                 华 中 农 业 大 学 学 报                                    第 41 卷

               GTSAAGGARACSGG - 3'、 5'- AGTTCTGS‐               多重比较（α=0.05）。采用 QIIME（Version 1.9.0）
               GTRGGCTTSAG - 3'），nirK基因引物为：F1aCu_R3             软件估算 nirS、nirK 基因的 α-多样性，采用未加权
               Cu（5' - TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA -               的 UniFrac 距离来计算多样性         ［19］ 。采用非度量多

                                                         ［15］
               3'、5' - TCTGGACCTGGTGAGTTTCC - 3'）           。 维度尺度分析（NMDS）可视化样本间群落结构的
               扩增条件（PCR 仪：ABI GeneAmp® 9700 型）为 ： 差异               ［20］ 。相似性分析（ANOSIM）被用来评估群落
               95 ℃预变性 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 结构的相似性和差异性              ［21］ 。用群落 barplot分析图来
               共 27个循环；然后在 72 ℃ 延伸 10 min；最后于 4 ℃保              表示不同样品间 nirS、nirK 基因的组成             ［22］ 。利用
               存。PCR 反应体系为：5×TransStart FastPfu 缓冲液             Canoco 5.0（Microcoputer Power，Ithaca，NY，USA），
               4 μL，2.5 mol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L） 采用基于 Bray-Curtis 距离的冗余分析（RDA）来解释
               0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart Fast‐     环境因子对反硝化群落的影响。
               Pfu DNA 聚合酶 0.4 μL，模板 DNA 10 ng，ddH 2 O 补        2   结果与分析
               足至 20 μL，每个样本 3 个重复。利用 Illumina 公司
               的 Illumina Miseq PE300 平台（上海美吉生物医药科              2.1  不同轮作休耕模式下土壤理化性质
               技有限公司）进行测序。                                          如表 2 所示，土壤 pH、碱解氮、速效磷、速效钾、
               1.6  数据分析                                        NO 3 -N 均为 A（CK）处理最低（P <0.05），且均为
                                                                   -
                   根据条形码的精确匹配，对不同样品进行 nirS、 B、C 处理的养分指数较高。而全氮、有机质、NH 4 -
                                                                                                           +
               nirK基因配对端读码解复，与条形码序列出现 1个或                       N 含量中，A（CK）、B 和 E 处理显著高于其他处理
               多个错配，或至少出现 2个与引物序列错配的读数被 （P <0.05）。土壤化学性质均为 B、C 处理更有利于
               丢弃   ［16］ 。然后利用 FLASH（fast length adjusting of   土壤肥力的增加，利于土壤氮含量的积累。在土壤
               short reads）将得到的读数进行合并，合并后的读数                    物理性质中，A（CK）处理的土壤容重显著高于其他
               至少有 10 bp 的重叠区域        ［17］ 。删除长度超出预期            处 理（P<0.05），分 别 高 出 0.81%、0.76%、0.86%、
               200~500 bp 的序列或含有任何模糊碱基的序列，获                     0.90%。E 处理的土壤含水率显著高于其他处理，其
               得的干净读取数分别为：421 362和232 177。经过筛                   次是 A 处理，E 处理显著高出了 32.14%、101.86%、
               选和嵌合体去除后，使用 UCLUST 以 97% 的序列同                    83.58%、780.87%。E 处理能有效降低土壤容重，改
               源性进行de novo操作分类单元（OTU）的筛选              ［18］ 。最   善土壤团粒结构，且保水性较好。结果表明，不同轮
               后，分别获得nirS和nirK基因OTUs 1 642和1 653 。              作休耕模式均能改善土壤肥力和土壤结构，并抑制
                   采用 Microsoft Excel 2019 处理数据；采用 SPSS         了土壤氮含量的流失，其中 B（紫云英-早稻-玉米||甘
               软件（version18.0，Chicago，Illinois，USA）对土壤理         薯）、C（油菜-甘蔗||春大豆）和 E（休耕）处理效果
               化性质进行方差分析（ANOVA），Duncan’s 法进行                    较好。

                                              表2   不同轮作休耕模式下土壤理化性质
                                              Table 2  Soil physicochemical properties
                   处理               AN/       AP/     AK/      TN/     SOM/   NH 4 -N/  NO 3 -N/  SBD/  SWC/
                                                                                 +
                                                                                         -
                            pH
                 Treatment         (mg/kg)  (mg/kg)  (mg/kg)    %      (g/kg)  (mg/kg)  (mg/kg)  (mg/kg)  %
                  A(CK)    4.78c   177.01b   41.58c   31.33d   2.00a   33.08a  14.32a   8.80b   2.01a  32.08b
                    B      5.73b   189.63a   74.34ab  61.67bc  1.92b   30.92a  15.56a  36.75a   1.11b  20.99c
                    C      6.28a   187.33a   80.98a   76.00a   1.95b   26.80b  9.19b   33.14a   1.14b  23.08c
                    D      6.11a   189.43a  74.02ab  70.00ab   1.93b   31.86a  9.49b   28.85a   1.08b   4.81d
                    E      6.14a   188.55a   70.01b   52.33c  1.96ab   33.22a  9.45b   29.56a   1.06b  42.37a
                 注：数据为 3个重复的平均值，同列不同小写字母分别表示在 5% 水平的显著差异（P <0.05）。SOM：有机质，AP：有效磷，AK：速效钾，
                                               -
                                   +
               AN：碱解氮，TN：全氮，NH 4 -N：铵态氮，NO 3 -N：硝态氮，SWC：土壤含水率，SBD：土壤容重。下同。Note：Data are the average of 3
               replicates，and different lowercase letters in the same column represent significant differences at the 5% level（P <0.05）. SOM：Soil organic
               matter，AP：Soil available phosphorus，AK：Soil available potassium，AN：Soil alkaline hydrolyzable nitrogen，TN：Soil total nitrogen，
                                          -
                  +
               NH 4 -N：Soil ammonium nitrogen，NO 3 -N：Soil nitrate-nitrogen，SWC：soil water content，SBD：Soil bulk density. The same as follows.
               2.2  不同轮作休耕模式下土壤反硝化潜势                           （CK）处理最高，其次是 E 处理，C 处理最低。各处
                   由图 1 可见 ，各处理的土壤反硝化潜势中 A                      理 分 别 低 于 A（CK）处 理 82.49%、93.23%、
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