Page 43 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第6期
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第 6 期                 徐慧芳 等：不同耕作模式对稻田土壤真菌丰度及群落结构的影响                                        37

               Wilmington，DE，USA）。凝胶电泳检测图显示所提                   component analysis）。Venn 图用于分析不同耕作模
               取的土壤总 DNA 条带未发生弥散，完整度较高，可                        式下真菌群落的结构相似性。采用 CANOCO 5.0的
               直接用于后续的PCR扩增。                                    db-RDA（distance-based redundancy analysis）分析环
               1.4  荧光定量PCR扩增及高通量测序                             境因子与真菌群落结构的关系，其中采取前置选择
                   采 用     Nu-ssu-0817F （5′-    TTAGCATG‐       法（forward selection）确定每个环境因子对真菌群落
               GAATAATRRAATAGGA-3΄） 和 Nu-ssu-1196R              结构的相对贡献率。
              （5΄-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3΄）对                 1.6  数据处理
               18S rRNA 进行扩增。扩增体系为 10 μL，包括上游
                                                                    使用 SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析。采
               引物（10 μmol/L）0.2 μL，下游引物（10 μmol/L）0.2
                                                                用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较不同耕
               μL，5 μL 的 SYBR GreenⅡ（TaKaRa），0.2 μL 的 Rox
                                                                作模式下真菌 18S rRNA 丰度的差异性；数据结果以
              （TaKaRa），DNA 为 1 μL（5 ng），补无酶水至 10 μL。
                                                               “平均值±标准差”表示，n=3；采用 LSD 多重比较对
               荧光定量 PCR 扩增程序为：95 °C 30 s，40 个循环的
                                                                数据进行差异显著性检验（α=0.05）；采用 Origin
               95 °C 5 s，60 °C 30 s。
                                                                2021和R软件进行绘图。
                   由于 18S rRNA 在大多数生物中趋于保守，生物
               之间的基因组序列变化不大，而其内转录间隔区                            2   结果与分析
              （ITS）作为非编码区相对变化较大，并且在物种注释
                                                                2.1  不同耕作模式下稻田土壤的真菌丰度
               分析时可以提供更加详细的物种信息，因此，我们采
               用 ITS 区域鉴定真菌的物种组成             ［12］ 。运用 ITS1F         从图 1可知，不同耕作模式之间真菌丰度存在显
              （5΄ -CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3΄） 和                 著 差 异 。 真 菌 丰 度 在 MRPOR 处 理（4.15 × 10        9
                                                                                                    9
                                                          ［13］
               ITS2R（5΄ -GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3΄）               copies/g）中显著高于 MROR（2.05 × 10 copies/g）
                                                                             9
               对 ITS 序列进行 PCR 扩增。扩增体系为 Mix（TaKa‐                与 DR（3.6×10 copies/g）（P<0.05）。MR（2.86×
                                                                  9
               Ra）12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）7.5 μL，下游引物            10 copies/g）的真菌丰度显著高于MROR（P<0.05），
              （10 μmol/L）7.5 μL，DNA 为 2 μL（40 ng），补无酶水          但 DR 与 MRPOR、MR 与 MRPOR 之间的真菌数量
               至 25 μL。PCR扩增程序为：95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s， 差异不显著（P>0.05）。
               55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 个循环；74 ℃ 9 min。PCR
               产物经琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒纯化后
               送到上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测
               序，基于 Illumina Miseq PE300 测序平台进行双端
               测序。
               1.5  高通量测序数据OTU聚类及群落组成分析
                   高通量测序得到的双端序列数据，根据序列首
               尾两端 barcode 和引物序列区分样品得到有效序列。
               过 滤 去 杂 的 数 据 采 用 97% 进 行 OTU（operational
               taxonomic units）聚类。为了得到每个 OTU 对应的
               物种分类信息，采用 RDP classifier 贝叶斯算法对各                  MR 代表中稻；DR 代表双季稻；MROR 代表中稻-油菜；MRPOR
               个基因的 OTU 代表序列进行分类学分析，设置分类                        代表中稻-小白菜-油菜。不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
                                                                下同。MR represents middle season rice；DR represents early rice-
               水平默认置信度阈值为 0.8，并在 phylum（门）水平上
                                                                late rice； MROR represents middle season rice-oilseed rape；
               统 计 各 个 样 本 的 群 落 组 成 。 真 菌 ITS 数 据 库 为
                                                                MRPOR represents middle season rice-pakchoi-oilseed rape. Differ‐
                                                    ［14］
               UNITE 8.0（http：//unite.ut.ee/index.php）  。真菌     ent lowercase letters indicate significant difference（P<0.05 ）. The
               ITS 的高通量测序数据已经上传至 NCBI 数据库                       same as below.
              （No. PRJNA836033）。                                       图1  不同耕作模式土壤真菌丰度的变化
                   真菌在不同耕作模式之间的群落组成差异分析                               Fig.1  The abundance of soil fungi under
                                                                            different farming patterns
               采用基于欧式距离的 PCA 主成分分析（principal
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