Page 38 - 《华农农业大学学报》2020年第4期
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华 中 农 业 大 学 学 报                                    第 ３９ 卷
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                ３
               表达量是高磷处 理 下 根 中 的 １４．６８ 倍 ( 图 ２A ); 此           均显著增加.这一结果暗示在低磷胁迫下, 为维持
               外, MtPAP３ 在 LPＧNFS 处理后根瘤中的表达量是                  根瘤共生中的磷稳态, 植物大量表达 MtPAP３ 来分
               NFS ( 含 １mol / L KH ２ PO ４ 处理后根瘤中的 １５．４８ 解储藏于植物细胞内储存的有机磷, 为根瘤的形成
                                       )
               倍( 图 ２B ), 该基因在低磷胁迫的根和根瘤中表达量                    和固氮提供磷元素.

















                A : MtPAP３ 在 LP ( ０．６８ m g / L KH ２ PO ４ ) 和 HP ( 浇 灌 Hon g land 营 养 液, １３６ m g / L KH ２ PO ４ ) 处 理 下 根 中 的 表 达 量; B : MtPAP３ 在
               LP ( ０．６８m g / LKH ２ PO ４ ) 和 HP ( 浇灌无氮营养液, １３６m g / LKH ２ PO ４ ) 处理下根瘤中的表达量. ∗ 表示经过非配对 Student ’ tＧtest分析, 试
               验组与对照组有显著性差异( P＜０．００１ ), 误差线代表平均值 ± 标准差, 数据是 ３ 次技术重复的平均值. A : Transcri p tlevelsofMtPAP３in
               rootsafterLPandHPtreatments ; B : Transcri p tlevelsofMtPAP３innodulesafterLPandHPtreatments．Asterisk ( ∗∗∗ ) re p resentssi g Ｇ
               nificantdifferencescom p aredwithcontroltreatments ( Student ’ tＧtest )( P＜０．００１ ) ．Errorbarsre p resentmeans±SD．Dataaretheavera g es
               ofthreetechnicalre p licates．
                                          图 ２  低磷处理下 MtPAP３ 在根和根瘤中的转录水平
                                 Fi g ．２ Transcri p levelsofMtPAP３inuninoculatedrootsafterLPtreatmentfor
                                          ７dandinoculatednodulesafterLPtreatmentfor２１d
               2.3  MtPAP3 组织表达定位                              提高固氮酶活, 进一步促进地上部分的生长.
                   为了检测 MtPAP３ 基因在根及根瘤中的表达                         MtPAP３ 基 因 敲 除 结 果 显 示, MtPAP３ 敲 除
               定位, 构建了 MtPAP３ p ro∶∶GUS 的组织表达定位                植株地上部长势较 差, 地 下 根 部 较 短 且 根 瘤 较 小
               载体, 利用 GUS 报告基因检测 MtPAP３ 在蒺藜苜                   ( 图 ６ ).
               蓿根瘤不同部位中的表达.结果显示: MtPAP３ 在                           对植株结瘤表型统计结果显示, MtPAP３ 敲除
               LPＧNFS ( 含 ５ μ mol / L KH ２ PO ４ 处理 ２８d 后的根     植株的鲜质量和固氮酶活均显著下降, 根瘤数量和
                                            )
               尖和根的中柱中均有表达( 图 ３A 、 B ), 且在根瘤维                  根瘤鲜质量没有显著性差异( 图 ７ ), 说明 MtPAP３
               管 束、 根 瘤 与 根 接 触 部 位 的 维 管 束 中 强 烈 表 达          基因的敲除影响到根与根瘤中磷的平衡与分配, 导
               ( 图 ３C 、 D ), 这 些 表 达 定 位 的 结 果 进 一 步 表 明       致根瘤因 缺 磷 而 固 氮 酶 活 下 降, 进 而 影 响 植 株 的
               MtPAP３ 与根瘤 形 成 和 发 育 过 程 中 的 磷 代 谢 分 配          生长.
               有关.                                                  为了进一步探究 MtPAP３ 是否与根瘤的发育
               2.4  MtPAP3 对共生固氮的影响                            相关, 随机挑选接菌 ２８d 后空载体植株、 MtPAP３
                   为了进一步探索 MtPAP３ 在共生固氮中的功                     超表达植株和 MtPAP３ 敲除植株根部 ５~１０ 个根
               能, 分 别 构 建 了 超 表 达 ( OE ) 和 敲 除 ( CRISPR / 瘤, 用 FAA 固定液进行包埋、 纵切、 苯胺蓝染色, 置
               Cas９ ) 载体, 通过蒺藜苜蓿毛根转化获得相应的转基                    于体式光学显微镜下观察( 图 ８ ).结果显示: 与空
               因植株, 浇灌 LPＧNFS 营养液, 接菌 ２８d 后分别检                 载体对照植株相比, 超表达植株根瘤固氮区含菌细
               测 ２ 组植株的共生固氮表型. MtPAP３ 基因超表                     胞较多且发育良好( 图 ８B 、 E ); 而 MtPAP３ 敲除植
               达结果显示, 超表达植株地上长势较好, 地下根部较                       株根瘤内含菌细胞较少, 分生区和侵染区基本没有
               长且密集, 根瘤大且数量较多( 图 ４ ).                          含菌细胞, 固氮区内含菌细胞多数发育不正常, 形态
                   对植株结瘤表型统计结果显示, 超表达植株地                       不饱满, 共生体膜明显皱缩, 且周质空间增大( 图 ８
               上鲜质量、 固氮酶活、 根瘤数量和根瘤鲜质量均高于                       C 、 F ), 表明 MtPAP３ 基因的超表达促进共生体根
               空载体对照 组 植 株 ( 图 ５ ), 说 明 低 磷 胁 迫 条 件 下, 瘤的发育, 而该基因的敲除抑制了植物机体内储存
               MtPAP３ 基因的过量表达能促进根瘤形成和发育, 的磷元素向根瘤转运, 严重影响根瘤的发育.
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