Page 37 - 《华农农业大学学报》2020年第4期
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第 ４ 期              崔智强 等:蒺藜苜蓿紫色酸性磷酸酶 MtPAP３ 基因在共生固氮中的功能                                  ３ １

                   ２ ) 农杆菌侵染与阳性毛根鉴定.用无菌的手术                     入 GUS 染液, ３７℃ 孵育过夜, 最后用 PBS 缓冲液冲
               刀切下胚芽根尖, 将根尖伤口刮取少量平板上含有                         洗表面浮色, 置于光学显微镜下观察.

               目标质 粒 的 发 根 农 杆 菌 A g．rhizo g enes MSU４４０
                                                               2 结果与分析
               菌落, 置于 FM 培养基上共培养 ７d , 然后用无菌手
               术刀切除根尖伤口处长出的非阳性根, 将幼苗移至                         2.1  MtPAP3 蛋白质序列分析和系统发育树构建
               HRE 固体培养基上生根１０~１５d ; 在体式荧光显微                         利用 NCBI和 Uni p rot数 据库分析可知, 蒺藜
               镜下, 通过 GFP 荧光筛选阳性植株.
                                                               苜蓿酸性磷酸酶基因 MtPAP３ ( medtr６ g ０１３０５０ ) 全
                   ３ ) 根瘤菌接种盆栽试验.鉴定的阳性幼苗常温
                                                               长 ４１３２b p 其中编码区 １６８９b p 编码 ５８７ 个氨基
                                                                                              ,
                                                                          ,
               炼苗 １d ; 随后将幼苗移栽至盛有无菌沙的盆砵中,
                                                               酸残基 的 蛋 白 质, 分 子 质 量 为 ６６．１６ku , PI 值 为
               浇灌 LPＧNFS 营养液, 放置光照培养箱; 待幼苗生长
                                                               ６．１４ . 蛋白结构分析显示 MtPAP３ 蛋白含有特异的
               ３~５d后, 接种根瘤菌 S．meliloti１０２１ , ３~４ 周后
                                                               金属磷酸酶结构域以及行使激活功能的活性位点.
               观察并统计共生表型.
                                                               将 MtPAP３ 蛋白质序列与拟南芥、 大豆、 鹰嘴豆和
               1.9  组织化学染色
                                                               水稻中的 PAP 蛋白序列进行序列比对和进化分析,
                   １ ) ２０mLGUS 染色工作液配置.将 １４．６ mL
                                                               构建系 统 进 化 树 ( 图 １ ). 结 果 显 示, MtPAP３ 与
               ５０mmol / LPBS 缓冲液、 ４００ μ L０．５ mmol / LEDＧ
               TA 、 １mL１０m g mLXＧGluc 、 ２０ μ LTritonXＧ１００ 、 GmPAP３１ 同 源 性 最 高,达 到 ７７．６８％ ,预 测
                              /
                                         [
               ４mL 甲醇以及 ０．０８４４gK ４ Fe ( CN )] 混合.              MtPAP３ 与 GmPAP３１ 具有相似 的功能, 可能参与
                                                 ６
                   ２ ) GUS 染色.将收获的根和根瘤清洗干净, 加                  低磷胁迫根瘤中的磷代谢.




































                                                    图 １ MtPAP３ 系统进化树
                                         Fi g ．１ Ph y lo g eneticanal y sisofMtPAP３withotherPAPs

               2.2  低磷胁迫对 MtPAP3 基因表达的影响                       饿处理 ７d 后的根和磷饥饿处理 ２１d 后的根瘤样
                   为了验证 MtPAP３ 是否参与植物应对低磷胁                     品, 抽 取 RNA , 进 行 RTＧPCR 分 析. 结 果 显 示:
               迫且参与蒺藜苜蓿根瘤中的磷代谢, 分别收取磷饥                         MtPAP３ 在低磷( ５ μ mol / L KH ２ PO ４ 胁迫根中的
                                                                                                 )
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