Page 36 - 《华农农业大学学报》2020年第4期

华 中 农 业 大 学 学 报 第 ３９ 卷
３
０
1.2 盆栽试验 MtPAP３ProF :
挑选颗粒大且饱满的蒺藜苜蓿种子, 用刀片在 AACTGCAGTTTGTTATTTCGTTGCTTCCAAATAC ;
种皮表面轻轻划出划痕, 然后将其移至 １００ mL 无 MtPAP３ProR :
菌的三角瓶中, 再倒入 ２％ 的次氯酸钠, 轻微振荡三 GCGTCGACTGTGTTGAATTGGATCCTCTAATGA .
用 PstⅠ 和 SalⅠ 双 酶 切 MtPAP３ 启 动 子
角瓶 ３~５min , 对种子表面灭菌, 直至种皮划痕变
PCR 产物, 回收片段, 并连接到 PstⅠ 和 SalⅠ 双酶
成褐色破裂伤口, 弃废液, 无菌水冲洗种子 １０ 次, 消
切过的启动子组织定位载体 DX２１８GＧmCherr y 将
,
除种子表面次氯酸钠残留; 最后留少许无菌水淹没
MtPAP３ 启动子片段置于 GUS 报告基因 N 端.
种子, 置于４℃ 冰箱暗处理春化２~３d ; 将吸胀的种
1.6 MtPAP3 编码区克隆及超表达载体构建
子移至 FM 平板上, 平板倒置 ２８℃ 黑暗处理 １０~
从 NCBI 数 据 库 中 查 询 到 MtPAP３
１２h , 此时种子已经长出约 １cm 的胚根, 然后将发
( medtr６ g ０１３０５０ ) １６８９b p 的编码区序列, 分别设计含
芽的种子移至含有无菌沙的花盆中, 分别进行接菌
有 XbaⅠ 和 AscⅠ 酶切位点的上下游引物, 以根瘤 cDＧ
和不接菌 ２ 种 处 理; 接 菌 组 分 别 浇 灌 无 氮 营 养 液
NA 作为模板进行 PCR 扩增, 引物如下:
( nitro g enＧfreenutrientsolution , NFS ) 和低磷无氮
MtPAP３OEF :
营养液( lowp hos p hatenitro g enＧfreenutrientsoluＧ
GCTCTAGAATGAAAATATGCAATTTTTGCA ;
/
tion , LPＧNFS ), 其 中 无 氮 营 养 液 含 １３６ m g L MtPAP３OER :
, / ; TTGGCGCGCCTTAATCCTTAAATCTAATCTGATTTAC .
KH ２ PO ４ 低磷无氮营养液含 ０．６８m g LKH ２ PO ４
用 XbaⅠ 和 AscⅠ 双酶切 MtPAP３编码区 PCR 产
不接菌组分别浇灌 Hoa g land 营养液和低磷 Hoa g Ｇ
land营养液( LPＧHoa g land ), 其中 Hoa g land 营养液 物, 回收片段, 并连接到 XbaⅠ 和 AscⅠ 双酶切过的超表
,
/
含１３６m g LKH ２ PO ４ 低磷霍格兰氏营养液含 ０．６８ 达载体 p L j U６ＧsGFP , 将 MtPAP３ 编码区置于百脉
m g LKH ２ PO ４ 幼 苗 放 置 于 光 照 室 ( １６ h 光 照 根泛素启动子 C 端.
,
/
２５℃ , ８h 黑暗 ２１℃ ) 培养. 1.7 sgRNA 引物序列设 计 及 CRISPR/Cas9 敲 除
1.3 蒺藜苜蓿 DNA 和 RNA 的提取 载体构建
采用天 根 公 司 植 物 DNA 提 取 试 剂 盒 ( Plant 在 CRISPRＧP２．０ ( htt p :// cris p r．hzau．edu．cn /
DNA minikit ) 提取各组织总 DNA , 采用艾德莱公 CRISPR２ /) 网站中检索 MtPAP３ 的 s g RNA 序列, 依
司植物总 RNA 提取试剂盒 ( TRI p ureRea g ent ) 提 据网站提供的靶位点区域、 GC 含量、 潜在脱靶率以及

取各组织总 RNA . 综合得分筛选出３个候选靶位点, 设计s g RNA 序列:
1.4 RT Ｇ PCR 分析 MtPAP３g RNA１ :
TTTGACTCATCACTGCGAAGAGG ;
将提取 到 的 RNA 采 用 诺 唯 赞 公 司 MＧMLV
MtPAP３g RNA２ :
( HＧ ) 反转录酶获得 cDNA ; 按照翊圣公司 q PCR 试
ACTTGCCTATGACTCATCCAAGG ;
剂盒( PCRSYBR Green MasterMix ) 进行基因表
q
MtPAP３g RNA３ :
达分析, 以转录延伸因子 EFＧ１α 作为内参基因, 上
GACATGATGAATAATACCAGAGG .
游引物: ACTGGTGGTTTTGAAGCTGGT , 下游引物 CRISPR / Cas９ 敲除载体的构建以 PTG 作为模
TGGTGGACCTCTCAATCATGT ; 目的基因 MtPAP３ 板, 获得tRNAＧ g RNA 多顺反子, 通过 Gibson 拼接
的上游引物: TGGTGGAAAGGGAGCTTCGT , 下游引 与中间载体 p Bluescri p tSK ( ＋ ) ＧL j U６ 连接, 最后连
物 GCTGCATAAACCTTCCCCAC . 接到 p CAMBIA１３００ＧsGFPＧCas９ 载体 [ １９ ] .
1.5 启动子克隆及组织表达定位载体构建 1.8 蒺藜苜蓿毛根转化
从 NCBI 和 p h y tozom v１１．０ ( htt p :// h y toＧ １ ) 种子处理.将表面含有划痕的种子在 ２％ 次
p
zome． jg i．doe． g ov / z / ortal．html ) 中 检 索 到 MtＧ 氯酸钠中消毒 ５min , 弃废液, 用无菌去离子水漂洗
p p
PAP３ 编码区( medtr６ g ０１３０５０ ) 上游 ９８６b p 的启动 种子 ８ 次, 最后预留些许水淹没种子即可, 置于 ４℃
子序列, 分别设计含有 PstⅠ 和SalⅠ 酶切位点的上 春化 ２~３d , 然后将吸胀的种子铺至 FM 固体培养
下游引物, 以低磷胁迫处理 ７d 的根部基因组 DNA 基, 倒置 ２８℃ 催芽 １０~１２h , 此时种子长出约 １cm
作为模板进行 PCR 扩增, 引物如下: 的胚芽, 待用.