Page 60 - 《华农农业大学学报》2020年第3期

第 ３ 期 吴佳 等:甘蔗鞭黑粉菌致病力差异菌株转录组分析 ５ ５

KEGG 富集等分析, 深入挖掘甘蔗鞭黑粉菌致病相 解, ２８SrRNA 和１８SrRNA 的条带清晰( 图 １ ).纯化
关基因, 旨在为揭示甘蔗鞭黑粉菌致病机制提供分 后的总 RNA 利用 A g ilent２１００进行 RNA 样品的完整
子基础. /
性检 测, 结 果 显 示, RIN 值 为 ８．３~１０ , OD ２６０ OD ２８０
/
1 材料与方法 为２．０６７~２．１８９ , OD ２６０ OD ２３０ 为 ２．３８０~２．５８１ .
说明总 RNA 受 蛋 白 质 和 其 他 有 机 物 等 物 质 污 染
1.1 供试菌株 少, RNA 的 纯 度 高, 可 用 于 后 续 的 文 库 构 建 和
供试 甘 蔗 鞭 黑 粉 菌 单 倍 体 菌 株 Ss１６ ( 强 致 病
测序.
力) 和 Ss４７ ( 弱致病力), 均由笔者所在实验室前期
2.2 转录组数据质量分析
分 离 鉴 定 获 得 [ １２ ] . 菌 株 在 YePSA 培 养 基 活 化
菌株 Ss１６ 和 Ss４７ 经 RNAＧSe q 测序后获得的
４８h , 用灭菌牙签小心挑取菌体经 YePS 液体培养
原始 测 序 序 列, 去 除 带 接 头、 未 知 碱 基 比 例 大 于
[ １３ ] , 离心取沉淀, 经液氮速冻后
基震荡培养 １~２d
１０％ 的reads和低质量的数据后分别获得 ８．３１G 和
寄北京诺禾致源科技股份有限公司进行后续的转录
９．８８G 的净化序列, 菌株 Ss１６ 的 Q２０ 及 Q３０ 均大
组测序.
于 ９１．５１％ , 碱 基 错 误 率 为 ０．０３％ , GC 含 量 为
1.2 甘蔗鞭黑粉菌总 RNA 的提取及质量检测
５７．６３％ ; 菌株 Ss４７ 的 Q２０ 及 Q３０ 均大于 ９４．３１％ ,
采用 Trizol方法提取甘蔗鞭黑粉菌总 RNA .
分别通过 NanoDro p 核酸检测仪和琼脂糖凝胶电泳 碱基错误率为 ０．０２７％ , GC 含量为 ５７．４３％ ( 表 １ ).
以上结果说明该测序结果可靠性高, 可用于下一步
检测总 RNA 的纯度和完整性.
1.3 测序数据分析 的分析研究.
Illumina转录组测序委托北京诺禾致源科技股
份有限公司进行.对原始数据进行质量控制去除低

质量、 未知碱基比例大于 １０％ 和带接头的数据后,
[ １４ ] 对数据
得到分析数据 cleanreads .利用 HISAT
[ １５ ] 进行基因差异表达
进行比对分析.采用 DESe q
[ １６ ] 注
分析, 阈值 P ad j＜０．０５ , 并对差异基因进行 GO
[ １７ ]
释及 KEGG 富集分析.
2 结果与分析 M : Trans２０００p lus ; １Ｇ３ : Ss１６ ; ４Ｇ６ : Ss４７．
图 １ 甘蔗鞭黑粉菌 Ss１６ 、 Ss４７ 菌株的 RNA 电泳检测
2.1 RNA 样品的质量检测 Fi g ．１ Gelelectro p horesisofRNAsam p les
琼脂糖凝胶电泳显示提取到的 RNA 基本无降 fromisolatesSs１６andSs４７ofS．scitamineum

表 １ 甘蔗鞭黑粉菌转录组测序质量统计
Table１ The q ualit y oftranscri p tomese q uencin gdataofS．scitamineum
样本 原始数据 净化读数 净化碱基 错误率 / ％ GC 含量 / ％
Q２０ / ％ Q３０ / ％
Sam p le Rawreads Cleanreads Cleanbases Error GCcontent
Ss１６Ｇ１ ５６７５０５１２ ５５９１４２９６ ８．３９G ９７．８７ ９４．０８ ０．０３０ ５７．６４
Ss１６Ｇ２ ５２５８４５８２ ５１１８８２８０ ７．６８G ９７．８９ ９４．１９ ０．０３０ ５７．６７
Ss１６Ｇ３ ６０１７９６３４ ５９１３１７１０ ８．８７G ９６．６９ ９１．５１ ０．０３０ ５７．５７
Ss１６ ５６５０４９０９ ５５４１１４２９ ８．３１G ９７．４８ ９３．２６ ０．０３０ ５７．６３
Ss４７Ｇ１ ７５８９２３４８ ７４１０２８９４ １１．１２G ９７．９５ ９４．３１ ０．０３０ ５７．２６
Ss４７Ｇ２ ６８３３８２７２ ６６０４３２５８ ９．９１G ９８．１４ ９４．７５ ０．０２０ ５７．５５
Ss４７Ｇ３ ５８３３５１６６ ５７３００６６６ ８．６０G ９７．９６ ９４．３４ ０．０３０ ５７．４９
Ss４７ ６７５２１９５９ ６５８１５６０６ ９．８８G ９８．０２ ９４．４７ ０．０２７ ５７．４３
2.3 差异表达基因的筛选 获得 ６４９ 个显著 DEGs , 以lo g ２ 差异倍数) 为横坐
(
使用 DESe q 对菌株 Ss１６ 和 Ss４７ 之间的差异 标, －lo g １０ P 值) 为纵坐标, 对显著的 DEGs 绘制
(
表达基因( differentiall yex p ressedg enes , DEGs ) 进 火山图( 图 ２ ), 结果显示, 在显著的 DEGs 中, 其中
行分析, 以 P ad j＜０．０５ 为标准筛选显著性 DEGs , 共 ２９９ 个基因上调表达, ３５０ 个基因下调表达.