Page 27 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第4期
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第 4 期                张晟国 等：堆肥发酵功能菌株的筛选及其在鸡粪好氧堆肥中的应用                                        21

               1    材料与方法                                       加入孔中，以空白液体培养基为对照，于 37 ℃培养
                                                                24 h 后观察打孔周围抑菌圈情况并测量其直径。在
               1.1  试验材料
                                                                混合培养基发酵过程中，分别取 4株菌 OD 600 值为 1.0
                   本研究中所用菌株均来自笔者所在课题组前期
                                                                左右的菌液，添加菌悬液量，采用 4 因素 3 水平的正
               从不同堆肥和土壤样品中分离的原有保存菌株。其
                                                                交试验确定 9 种不同组合，最终确定菌株的最佳配
               中，饲料类芽胞杆菌（Paenibacillus pabuli）5-1、台中
                                                                伍。发酵过程中活菌数采用平板涂布法计数，并测
               类芽胞杆菌（Paenibacillus taichungensis）6-6 和红球
                                                                定其吸光值（OD 600 ）。
               菌（Rhodococcus hoagii）K4-1 在中国典型培养物保
                                                                1.5  复合菌剂接种鸡粪好氧堆肥的应用效果研究
               藏中心的保藏编号分别为 CCTCC NO：M2021574、
                                                                    1）鸡粪好氧堆肥试验。鸡粪因含有较高的氮素
               CCTCC NO：M2021575 和 CCTCC NO：M2021573。
                                                                养分，是有机肥生产常用的原材料。本研究堆肥试
               复合菌剂Ⅲ是笔者所在课题组曹蕊前期研制的堆肥
                                                                验于 2020 年 12 月在华中农业大学试验养鸡场内进
               菌剂配方（枯草芽胞杆菌 BS2∶解淀粉芽胞杆菌 Ba∶
                                                                行。堆肥试验采用鸡粪为原材料，锯末为堆肥辅料。
               地衣芽胞杆菌 BL1∶酿酒酵母 SC=3∶1∶3∶4）（专利
                                                                其中，测定堆肥原材料锯末和鸡粪的初始 C/N 和含
               号：ZL202010616986.0）。
                                                                水率，锯末的 C/N 为 125.6，含水率为 10.45%；鸡粪
                   堆肥原材料鸡粪来自华中农业大学实验鸡场，
                                                                的 C/N 为 8.72，含水率为 71.69%。调节堆肥 C/N
               辅料锯末来自华中农业大学动物医院。                                比 为 25∶1 左 右 ，含 水 率 为 50%~60%，最 终 按 鸡
               1.2  主要仪器与设备                                     粪∶锯末=6∶1 比例充分混合。共设置 4 个处理组，
                   Vario PYRO cube 元素分析仪，德国 Elementar；          空白对照组（CK）、复合菌剂Ⅰ组（ABⅠ）、复合菌剂
               LH3-CNP 氨氮总磷测定仪，杭州陆程仪器有限公                        Ⅱ组（ABⅡ）、复合菌剂Ⅲ组（ABⅢ）。本研究的复合
               司；722E 紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；                       菌剂Ⅰ和Ⅱ是在复合菌剂Ⅲ的基础上进行改进。在
               WT20003 电热恒温培养箱，上海天呈实验仪器制造                       堆肥起始时将复合菌剂按堆体体积的 1% 比例进行
               有 限 公 司 ；AB204-N 分 析 天 平 ，瑞 士 METTLER            喷洒添加，混匀。
               TOLEDO。                                              堆肥箱连接通风系统进行鼓风，整个堆肥试验
               1.3  功能菌株的筛选                                     在环境温度 17~20 ℃的温室小棚内进行。堆肥试验

                   将待测菌株分别接种于酪素培养基、淀粉培养                         装置为容积 60 L、厚度 30 mm 的 EPS 泡沫箱（高 280
               基、刚果红羧甲基纤维素钠培养基，观察菌落周围是                          mm、长 540 mm、宽 400 mm）。泡沫箱底部铺满 3 cm
               否有无色透明圈出现，计算出透明圈直径和菌落直                           左右的锯末作为通风缓冲层，侧面开 1个小孔便于测
               径之比，判断菌株产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶能力。                         定温度，定时通风，保证均匀的通风量。在为期 14 d
                   将各个菌株分别接种到含 10% NH 4 培养基中，                   的鸡粪好氧堆肥过程中，各试验组的温度均经历了
                                                  +
               连续传代 3 次，对能在含 10% NH 4 培养基上生长                    升温期、高温期、降温期和腐熟期，分别于堆肥第 1
                                               +
               的菌株进行除臭能力分析。将筛选的菌株分别培                            天、第 4 天、第 7 天和第 14 天采集样品。采用 5 点取
               养 24 h 制成菌悬液 20 mL，与 200 g 新鲜鸡粪均匀混               样法用无菌小铲采集堆体样品，混合均匀，置于样品
               合，置于 1 000 mL 大烧杯中，内置 50 mL 小烧杯，小                袋中，分别于4 ℃和-20 ℃冰箱保存。
               烧杯加入 20 mL 0.05 mol/L 硫酸，进行氨气的吸收，                    2）堆肥常规理化性质的测定。堆肥理化指标的
               保鲜膜封口大烧杯，每组重复 3 次。同时，将添加等                        测定方法参照农业行业标准 NY/T 525－2012《有机
               量蒸馏水不加菌悬液作为空白对照组。整个试验于                           肥料》进行，分别测定堆肥过程中温度、含水率、pH、
               50 ℃下进行，采用 NaOH 中和滴定法隔天测定氨气                      种子发芽指数（GI）和有机质含量的变化。称取新鲜
               释放量，并计算氨气释放率。                                    堆肥样品 5~10 g 放入坩埚内，于 105 ℃的烘箱中烘
               1.4  复合菌剂的制备                                     干后粉碎过筛，精确称量 4~5 mg 烘干样品，研磨使
                   采用打孔法对功能菌株之间的拮抗性进行测                          其粒径小于 0.15 mm，用锡箔纸包被，使用元素分析
               定，将菌株分别制备成菌悬液，均匀涂抹至培养基表                          仪测量样品中总 C、N 含量。铵态氮采用氯化钾浸
               面，使用打孔器等距离四点打孔及中心打孔，并将孔                          提-靛酚蓝比色法测定、硝态氮测定采用双波长紫外-
               底部进行火焰封底，吸取其余待测菌株菌悬液 50 μL                       分光光度法。纤维素酶活性采用 3，5-二硝基水杨酸
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