Page 45 - 《华农农业大学学报》2020年第4期

第 ４ 期 胡倡 等:解磷菌和根瘤菌复合接种对大豆和紫云英共生固氮的影响 ３ ９

株, 根际土壤样品取自大豆根际土壤. 上, ２８℃ 正置催芽 ２~３d .土壤取自湖北省石首市
供试 菌 株: Mesorhizobium huakuii７６５３R ( 简 大垸镇.土壤性质如下: 速效钾 １０１．３１ m gk g 速
/ ,
称 ７６５３R ); Sinorhizobium f redii HH２９ ( 简 称 效磷 ６．３５m gk g 有机质含量１２．６６gk g 全氮 ０．１８
/ ,
/ ,
HH２９ ); Brad y rhizobium j a p onicum USDA１１０ gk gp H７．３０ .将土壤过 ２ mm 筛, 催芽后的种子
/ ,
( 简 称 USDA１１０ ); Sinorhizobium f redii HH１０３ 播种到装有未灭菌土壤的小盆中, 装土量 ４５０g 左
( 简称 HH１０３ ). 右, 每钵播种 ２~３ 颗大豆种子.试验共设 ４ 个处
分离样品的处理: 将大豆根系的泥土压碎并抖 理, 每个处理 ６ 个重复, ５d 后间苗.等到植物长出
落, 用灭菌镊子取约 ２０ 个大豆根瘤, 用无菌水漂洗 第 １ 片真叶, 离心并收集菌体, 用无菌水调节 OD ６００
６~７ 次, 捣碎后于 ５ mL 离心管中充分振荡混匀. 至 １．７~１．８ .按照以下处理在植物根系附近接入对
稀释原液 １０ 、 １０ 、 １０ 并涂布于解无 机磷培养 应的菌 液.处 理 １ : 单 接 种 S． f redii HH２９ 菌 液
－２
－３
－１
基, ２８℃ 培养.大豆沿主根剪断浸入含有５０mL 已 １mL ; 处理 ２ : 单接种从大豆根瘤材料分 离得到的
灭菌水的三角瓶中, ２２０r / min 振荡 ３０min 作为原 解磷菌 PSBＧ１１ mL ; 处理 ３ : 接种按等质量混合的
液, 将原液稀释至 １０ 、 １０ 、 １０ 并涂布于解无机 大豆根瘤菌和解磷菌 PSBＧ１ 菌液 １ mL , 对照植株
－２
－４
－３
磷平板, ２８℃ 培养.解无机磷平板配方如下: 葡萄 加入 １ mL 无菌水.对 大 豆 根 瘤 菌 B． j a p onicum
,
)
,(

糖 １０g NH ４ ２ SO ４０．５g M g SO ４ ７H ２O０．３g , USDA１１０ 采用从大豆根际土壤分离得到的解磷菌
, , ４H ２O ０．０３g , HZP１ 进行单接种和混合接种, 在光照培养室( ２４~
NaCl０．３g KCl０．３g MnSO ４
FeSO ４ ４H ２O０．０３６g Ca ３ PO ４ ２１０g 补 ddH ２O ２８℃ , １６h 光照 / ８h 暗期) 生长, ２d 浇 １ 次灭菌蒸
,
(
)
,

[ １６ ] 馏水.接菌 ２８~３０d测定植物表型, 包括植物鲜质
至 １L ,调 p H６．８~７．０ .
1.2 细菌溶磷量、 IAA 含量测定及 16S rDNA 鉴定 量、 根瘤数、 根瘤质量、 固氮酶活等.固氮酶活测定
挑取单菌落接于 ５ mLLB 中, ２８℃ 培养 １２h 参见伍惠等 [ １９ ] 的方法.
作为一级种子液, 按 １％ 接种量重复此操作作为二 ２ ) 紫云英土壤盆栽试验.紫云英种子放在灭菌
级接种液.最后以 １％ 接种量转入 １００ mL 解无机 PA 瓶中, ７５％ 乙醇 ５min , ５％ ( V / V ) 次氯酸钠表面
磷培养基中. ２８℃ 培养 ６０h , 用钼锑钪比色法测定 消毒 １０min , 无菌水洗涤 ８~１０ 次后用无菌水浸泡
发酵液中可溶性磷含量, 对照加入等量无菌水的解 ４~６h , 平铺在 １％~２％ 的水琼脂平板上, ２０℃ 光
无机磷培养基.标准曲线的制作及具体方法主要参 照倒置催芽 ２~３d 后, 将土壤过 ２ mm 筛, 催芽后
照文献[ １７ ] 进行. 的种子播种到装有 ２５０g 未灭菌的石首土壤与灭菌
挑取单菌落接于５mLLB 液体中, ２８℃ 过夜培 蛭石混合物( m 土壤 ∶m 蛭石 ＝３∶１ ) 的盆中.每钵 ４ 粒
养作为种子液, 细菌在 LB＋LＧ 色氨酸( ０．５g L ) 液 种子, 试验共 ４ 个处理, 每个处理 ５ 个重复.试验设
/
体培养基中生长 １２h , 培养液离心取上清液 ４mL , 计与大豆盆栽类似, 菌种分别采用 ２ 种解磷菌 PSBＧ
加入等体积 Salkowski比色液, 黑暗静置 ３０ min , １ 、 HZP１ 和 M ．huakuii７６５３R 进行.在光照培养
以加入等量LＧ 色氨酸的 LB 液体培养基为对照测定 室( １６h 光照 / ８h 暗期, １８~２２℃ ) 生长, 接菌方式
发酵液在 ５３０nm 处的吸光度. IAA 标准曲线测定 及表型测定与大豆相同.
及相关溶液配制参考文献[ １８ ] 进行. 1.4 田间试验设计及菌剂制备、 使用方法
提取 细 菌 基 因 组 并 用 １６S 通 用 引 物 ２７F / 湖北小区试验设在石首市大垸镇试验田, 土壤
１４９２R 进行 PCR 扩增, 将获得的目的片段通过胶回 同大豆盆栽试验.前茬小麦, 土壤有效磷、 有效钾含
收, 之后连接 T 载体转化至大肠杆菌中.挑取相应 量低; 播种前１d翻耕, 保持土壤湿墒.播种中黄１３
单菌落进行 PCR 验证, 挑选 PCR 验证正确的菌株, 和荆豆 １３４ ; 大豆根瘤菌菌种为 B． j a p onicum USＧ
将菌 株 培 养 后 送 测 序 公 司 测 序 获 得 １６SrDNA DA１１０ 、 S． f redii HH１０３ ; 解磷菌菌种选择 HZP１
序列. 拌种.每个小区宽 ４．８ m 、 长 ５ m , 小区间留 ０．４ m
1.3 盆栽试验 长走道, 试验田四周至少 １m 宽的保护行.每个小
１ ) 大豆土壤盆栽试验.选颗粒饱满的中黄 １３ 区开 １０ 行播种沟, 每行播种 ２００g 种子, 待出苗后,
大豆种子, ７５％ 乙醇消毒 ５ min , ５％ 次氯酸钠消毒 按每 １０cm 保留 １ 株的标准间苗.试验设 ５ 个处
５min , 无菌水洗涤 ８~１０ 次.铺于 １％ 水琼脂平板 理, 处理 １ ( CK ):不接菌剂, 常规播种; 处理 ２ ( R１ ),