Page 54 - 《华农农业大学学报》2020年第3期

第 ３ 期 周默 等:人参灰霉病菌 Botr y tiscinerea 的种群表型和基因型多样性 ４ ９

表 ２ PDA 培养基上 B．cinerea 的表型特征
Table２ Phenot yp iccharacterizationofB．cinereaisolatesonPDAmedium
表型 菌丝类型“ M ” M y celialt yp e ‘ M ’ 菌核类型“ S ” Sclerotialt yp e ‘ S ’
Phenot yp e M１ M２ M３ M４ S１ S２ S３ S４ S５
气生菌丝 气生菌丝丰富、 菌丝密 较短 较短 较短 较短 气生菌
菌丝 短 丰富、 均匀 成簇分布 集似羊毛 Rather Rather Rather Rather 丝丰富
M y celium Short 分布 M y celial Thickand short short short short Aerial
Aerial masses wooll y
分生孢子
－ ＋ ± － ± ± ± － ＋
S p orulation
菌核分布于 菌核较大、 菌核较大、 菌核小而 菌核小而
培养基边缘 环形分布 无规则分布 多且分散 多且分散
菌核 Sclerotia ０ － － － Intheed g e Oftenlar g e , Oftenlar g e , Numerous , Numerous ,
of p etridish incircle p laced smalland smalland
irre g ularl y scattered scattered
注: ０ : 无; － : 无或极少; ± : 或多或少形成孢子; ＋ : 形成大量孢子. Note : ０ : Absence ; － : Absenceorver y rare ; ± : Moreorlesss p orulaＧ
tin g ; ＋ : S p orulatin gp rofusel y ．
计测量 DNA 的浓度.置于 －２０℃ 保存. 每个菌株接种 ３ 片叶子, 重复 ３ 次.
1.4 转座因子的检测 所有的统计检验均在 SPSSv２５．０ 中进行.使用
使 用 Bot y ＧSF ( ５′ＧGAAGGCAAGATGCCTＧ Pearson ’ s卡 方 验 证 确 定 显 著 差 异, 采 用Duncan ’ sＧ
GTGCACACCＧ３′ )/ Bot y ＧSR ( ５′ＧGACAACACATＧ LSR 试验, 在α＝０．０５ 的 条 件 下, 分 析 平 均 病 斑 直
TGTTCATAAGCCTCAＧ３′ ) 以 及 F３００ ( ５′ＧGCAＧ 径.根据不同分离株对人参叶片的致病性, 计算并
CAAAACCTACAGAAGAＧ３′ )/ F１５００ ( ５′ＧATＧ 分析致病性与转座子类型的相关性.
[ １５ ]
TCGTTTCTTGGACTGTAＧ３′ ) 检 测 人 参 灰 葡
2 结果与分析
萄孢中的 Bot y 和 Fli pp er . PCR 反应体系( ２５ μ L )
为 DNA 模板 １ μ L , Ta q PCR Mix１２．５ μ L , 上下引 2.1 菌落形态多样性观察结果
根据菌丝、 分生孢子以及菌核的特征将所有的
物各 １ μ L , ddH ２O９．５ μ L . PCR 反应程序为: ９５℃
预变性５min ; ９４℃ 变性４０s , ５５℃ / ４４℃ 退火４０s ,
菌株分成 ２ 大类: 第一类菌丝型, 包括 ３ 个亚类: M２
７２℃ 延伸 １min , ３５ 个循环; ７２℃ 延伸 １０min .将 表型、 M３ 表型、 M４ 表型; 第二类菌核型, 包括 ５ 个
PCR 产物进行 １％ 琼脂糖凝胶电泳, 于紫外光下观
亚类: S１ 表型、 S２ 表型、 S３ 表型、 S４ 表型、 S５ 表型.
察结果.
本试验中所分离的人参灰霉病菌 B．cinerea 没有出
1.5 交配型基因的检测
现 M１ 表 型, 其 他 ８ 个 表 型 的 分 离 比 率 分 别 为
检测交配型 MAT１Ｇ１ 或 MAT１Ｇ２ 是否存在,
５．８４％ 、 １１．０４％ 、 ５．１９％ 、 １６．２３％ 、 ７．１４％ 、 ２５．３２％ 、
使用引物 BcMAT１ＧF / BcMAT１ＧR 和 BcMAT２ＧF /
４．５５％ 和 ２４．６８％ .菌丝型总分离比率为 ２２．０８％ ;
[ １２ ] 进行扩增, 反应体系同本文材料与方
BcMAT２ＧR
菌核型总分离比率为 ７７．９２％ ( 图 １ ).
法中“ １．４ ”, PCR 反应程序为: ９４ ℃ 预变性 ５ min ;
2.2 人参灰霉病菌转座因子类型
９４℃ 变性 １min , ５５℃ 退火 ４５s , ７２℃ 延伸 １min , 使用 Bot y 和 Fli pp er的特异性引物测定分离物
３２ 个循 环; ７２ ℃ 延 伸 １０ min . 将 PCR 产 物 进 行
所含的转座因子类型( TEs )( 图 ２ ).人参灰霉病菌
１％ 琼脂糖凝胶电泳, 于紫外光下观察结果.
1.6 不同转座因子类型致病性比较 B．cinerea 共包含 ３ 种转座因子类型: Trans p osa 、
Bot y 和 Fli pp er ; 分离频率从高到低分别为 TransＧ
采用菌丝饼接种法进行致病性测定, 分别从 ３
个不同转座因子类型中各选取 ５ 个菌株进行试验. p osa ( ９３．５０％ )、 Bot y ３．９０％ )、 Fli pp er ( ２．６０％ ), 本
(
试验中没有发现 Vacuma类型, 在尚志市、 抚松县和
在 ２０℃ 的黑暗条件下, 将每株灰葡萄孢菌在 PDA
上培养３d , 然后从菌丝边缘切下直径为５mm 的菌 安图县 ３ 种转座因子类型也呈现出类似的趋势, 但
丝饼贴附到每个人参叶片( ５ 年生人参同一部位的 也有一些不同的情况, 其中从靖宇县、 长白县、 桓仁
健康离体叶片) 上.接种前用 ７５％ 的乙醇对叶片的 县和清原县所收集的菌株中仅包含 Trans p osa 类
表面消毒约 ３ min , 并 用 灭 菌 的 蒸 馏 水 冲 洗 ３ 次. 型.仅在集安市、 抚松县和安图县分离的菌株中发
将接种后的叶片置于 ２０℃ 的培养箱中, 光暗交替. 现少量含有 Fli pp er转座因子的菌株( 图 ３ ).