山药中含水量约80%,皮薄且肉质脆嫩,在采收及运输过程中容易发生机械损伤,不经过处理、没有形成愈伤组织的山药受潮易变软发黏,变黄,容易感染霉菌,发生腐烂变质。这不仅不利于采后山药的储藏,还会对其商品价值造成较大影响[1-2]。对山药采取及时有效处理能加速愈伤组织形成,从而降低因机械损伤导致的山药品质劣变。此前已有研究表明适当提高愈伤的温度能有效促进机械损伤山药的愈伤[3],而且损伤山药组织受病原菌侵染也会导致愈伤组织形成缓慢甚至失败。若愈伤前期对山药进行化学诱抗剂处理,通过提高组织系统抗病性,则能减少因病原菌侵染损伤组织导致的愈伤失败。而诱抗剂β-氨基丁酸(BABA)及碳酸氢钠(NaHCO3)在多种果蔬中应用均证实能明显减少植物病害,目前取得了较好的效果。β-氨基丁酸(BABA)作为一种非蛋白质氨基酸,具有抗真菌活性及诱导部分植物组织产生防御反应的作用[4],在已知研究中BABA还通过增强系统获得性抗性基因的表达诱导抗性[5],对马铃薯晚疫病、烟草高盐胁迫、葡萄灰霉病、苹果青霉病等植物的诱导抗病性均有良好的效果。NaHCO3是一类无机的、安全、常用的食品添加剂,是国际有机食品允许使用成分之一。NaHCO3对柑橘、胡萝卜、辣椒和柠檬等果蔬采后病害的防治有较好的效果,其通过改变环境的pH值以达到抑制真菌生长的目的[6]。吴武等[7]研究发现,NaHCO3与其他方法联用可以达到更好的防腐保鲜效果。2种化学诱抗剂与其他试剂结合使用均有较多研究,并在采后果蔬抗病中有较好效果,但对以上2种化学诱抗剂应用在采后山药抗病性及对其愈伤效果的研究几乎没有。因为BABA对部分病原菌的抑制作用具有浓度依赖效应[8],所以本试验在前期筛选出药剂合适浓度基础上[9],采用1 mmol/L BABA和1 mmol/L NaHCO3复合处理损伤山药,通过评价愈伤程度及抗病性,探究 BABA协同NaHCO3对机械损伤山药愈伤及抗病性诱导可能机制,以期为果蔬愈伤与贮藏提供参考。
采用外观整齐、粗细均匀、无病虫害及无损伤的菜山药(Dioscoreae rhizoma),以1%NaClO溶液清洗后切段(长度5 cm)备用。愈伤处理参考Bajji等[10]的方法,药剂均用无菌水配制成浓度1 mmol/L溶液,定量均匀涂布于断面上,以涂布无菌水山药段为空白组。晾干后将山药段装盒、套袋,于35 ℃(RH 85%)生化培养箱孵育,每组均使用30段山药,并重复3次。
栓化程度以聚酚软木脂(suberin poly phenolics,SPP)观察和木质素含量为评价指标,荧光及染色观察参考Lulai等[11]及Van等[12]方法,并稍作修改。SPP观察方法为将愈伤组织切成薄片后于荧光显微镜下观察荧光反应。木质素沉积观察采用间苯三酚-HCl法染色后,在光学显微镜下观察显色。木质素含量的测定采用乙酰溴法[9]。
损失率采用差量法[9]测定。山药愈伤7 d后在65 ℃恒温孵育,每隔30 min称质量。
选用致病菌为天一辉远公司菌种鉴定的扩展青霉(Penicillium expansum)。菌饼制作参考刘灿[9]的方法,将菌饼接种于愈伤3 d的山药损伤面中心,在25 ℃生化培养箱培养7 d后测定菌斑直径。腐烂直径测定方法参考葛永红等[13]的十字交叉法并稍作修改。
总酚及黄酮含量测定分别采用福林酚法和硝酸铝-亚硝酸法[9]。
过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)含量测定于410 nm波长下测定吸光值[9]。超氧阴离子测定采用羟氨氧化法[9],于530 nm处测定吸光度值。
数据采用Excel 2003处理,并用Origin 8.0软件作图,用SPSS 18.0软件进行差异性显著分析。
如图1A所示,温度处理对伤口水分损失的影响较药剂处理显著。愈伤形成的封闭层不仅能有效防止水分散失,同时也能抵抗病原菌的入侵。1 mmol/L BABA结合NaHCO3复合处理能有效降低切面腐烂程度。35 ℃下愈伤山药块茎损失率高于25 ℃下愈伤,表明适当失水可能促进表面伤口细胞的栓化。药剂处理组损失率均低于35 ℃空白组(CK),但是组间无显著差异。如图1B所示,愈伤3 d后,35 ℃各组腐烂程度明显小于25 ℃处理组(P<0.05),各药剂处理后山药损伤部位腐烂程度均小于空白组,1 mmol/L BABA结合NaHCO3复合处理后山药腐烂程度最低(P<0.05)。单一药剂处理组与35 ℃空白组的腐烂程度差异不显著。结果表明复合处理诱导植物产生抗病性物质(木质素、酚类等),有助于细胞壁木质化聚合的加强和增厚,在一定程度上抑制了损伤部位失水,阻止微生物进入组织发生侵害。
图1 不同药剂处理对损伤山药损失率(A)和腐烂程度(B)的影响
Fig.1 Effects of different curing treatment on weight loss rate (A) and the decay degree (B) of the wounding yams
如图2A所示,各组软木脂含量随愈伤时间延长而增加。1 mmol/L BABA结合NaHCO3处理较其他组能有效促进软木脂在细胞壁上的积累。存在于植物外层细胞壁中的软木脂是一种天然的芳香族聚合物,在紫外光激发下会发出蓝绿色荧光。山药切片荧光信号在伤口愈合过程中增加,说明软木脂在细胞中逐渐积累;随着愈伤时间的延长,荧光区域逐渐扩大,即软木脂沉积增强。
结果表明,经复合药剂处理后,创伤组织中荧光强度最高,表明软木脂在细胞壁上的沉积程度提高;图2A中25 ℃下处理愈伤至5 d,损伤外层细胞壁出现不连贯、片段式荧光信号。愈伤7 d时,荧光信号增强且连续出现在损伤细胞壁上,表明此时软木脂均匀分布于同层细胞壁上;35 ℃下愈伤时,BABA结合NaHCO3处理切面相较药剂单独处理,在第1天出现轻微的荧光响应,在第3天荧光信号变强且为不连续荧光片段,5 d后荧光强度继续增强、层数增多,软木脂开始在下一层细胞中积累;较空白对照组在损伤细胞壁中提前出现完整一层的细胞荧光响应,此时损伤部位的封闭层形成,损伤切面具有抵抗病原真菌的抗性。
如图2B所示,随着愈伤时间延长,山药切面细胞壁上的木质素沉积变多。木质素在细胞壁上积累经染色后呈现紫红色。细胞壁中木质素沉积较软木脂延迟2~3 d后产生,温度处理对木质素沉积影响较大。25 ℃下愈伤显色反应出现在第5天,颜色较淡,显示木质素开始少量积累在细胞壁上,愈伤至第7天,木质素分布于第1层伤表皮细胞,但颜色反应较弱;35 ℃处理组木质素积累均提前2 d,与25 ℃组差异显著。1 mmol/L BABA结合NaHCO3复合处理处理后木质素在最外两层细胞壁上显色,木质素快速合成,分布层数、沉积程度高于其他组(P<0.05),木质素含量在愈伤期间保持在较高水平(P<0.05)(图2C),BABA处理组次之(P<0.05),NaHCO3处理效果与对照组无明显差异,对愈伤期间木质素含量的变化水平测定结果与其染色结果具有一致性。
综上所述,复合药剂处理较单一药剂处理能更有效促进木质素的积累,木质素在损伤切面上快速大量聚集并分布于细胞壁中,可以增强细胞壁厚度,有效抵抗微生物侵染并控制组织水分损失。
山药愈伤期间,1 mmol/L BABA结合NaHCO3复合处理后,总酚及黄酮含量水平均明显高于其他组(P<0.01)。如图3A所示,总酚含量随着愈伤时间呈上升趋势,BABA结合NaHCO3复合处理与其他组愈伤前期总酚积累差异明显(P<0.01),总酚含量在愈伤前期积累水平较高,第3天积累量达到最大,愈伤后期积累量趋于平稳,第7天各组总酚含量趋于一致。如图3B所示,随着愈伤时间的延长,黄酮积累呈现先增加后减少的趋势。提高愈伤温度明显促进了黄酮的积累(P<0.01)。1 mmol/L BABA结合NaHCO3复合处理组较其他组黄酮的积累量更高(P<0.01),且在愈伤第7天仍保持高水平。表明在愈伤前期,复合处理有效、快速提高了损伤组织积累酚类、黄酮等次生代谢物质的能力,与木质素沉积趋势具有一致性,作为软木脂及木质素合成所需酚前体物质,总酚及黄酮大量积累有助于封闭层的快速形成。
图2 不同药剂处理后损伤山药SPP(A)
和木质素沉积(B)及木质素含量(C)
Fig.2 Effects of different curing treatments
on the SPP(A),accumulation of
lignin(B)and the content of lignin(C)
如图4A所示,愈伤期间,H2O2的含量逐渐增加,复合处理组在1 d后H2O2的含量迅速增加,与其他处理组差异明显(P<0.01)。35 ℃下处理组较25 ℃处理,H2O2的积累明显增多(P<0.01),BABA、NaHCO3单独处理H2O2的含量变化差异不大(P>0.05)。表明复合处理能促进H2O2在损伤部位大量积累。如图4B所示,产生速率呈现出在第1天迅速上升、此后开始下降的变化趋势;药剂处理组活性与其他组均有明显差异(P<0.01);1 mmol/L BABA结合NaHCO3复合处理后产生速率愈伤期间高于其他组(P<0.01)。BABA、NaHCO3单独处理愈伤期间差异不明显(P>0.05)。表明复合处理能有效提高超氧阴离子的产生速率,其大量积累与木质素的合成积累相关。
图3 不同愈伤处理对总酚含量(A)和黄酮含量(B)影响
Fig.3 Effects of different curing treatment on the contents of total phenol (A) and flavonoids(B)
at the wounding sites of yams stored for 7 days
图4 药剂处理对山药块茎伤口处H2O2含量(A)和产生速率(B)的影响
Fig.4 Effects of different curing treatment on the contents of H2O2 (A) and production rate(B)
at the wounding sites of yams stored for 7 days
研究表明BABA具有诱导植物组织获得广谱抗病性的作用[14],并在部分植物/病原菌相互作用中具有特异的诱导抗性[15]。BABA诱导植物抗性的机制因植物类型而异,在没有植物病原菌生物胁迫的情况下,番茄、辣椒和烟草植株中可能出现与BABA相关的PR蛋白水平升高[16]。在十字花科植物中,PR蛋白水平仅在受病原菌感染的生物胁迫后才升高[17]。较低浓度BABA更能诱导植物产生对多种病原菌的抗性,且不影响病原菌菌丝生长[18]。NaHCO3可与其他化学药剂、生物制剂或者物理方法等结合使用[19],用于采后果蔬病害的防治,在梨、柑橘类、草莓、李子、马铃薯等果蔬病菌防治中均有较多研究应用[20-21]。本研究结果表明1 mmol/L BABA结合NaHCO3处理可能通过激活苯丙烷类代谢途径及氧化爆发,使损伤山药产生系统获得性抗性;较高温35 ℃处理,复合药剂处理提高了H2O2产生水平,刺激伤口周围积累大量苯丙烷代谢末端产物,山药伤口周围表皮细胞提前栓化形成封闭层,强化的细胞壁结构能较好地维持损伤组织水分,抵抗致病菌及虫害侵染,从而保证采后山药贮藏的品质。
因此,BABA结合NaHCO3处理改变山药组织生理水平变化不依赖于病原菌的生物胁迫作用,而是直接诱导损伤山药产生抗病性的能力,使山药组织表现出较高愈伤效率。1 mmol/L BABA和NaHCO3 复合处理较BABA及NaHCO3单一药剂处理对机械损伤山药诱抗效果更佳,愈伤期间受病菌侵染后的腐烂程度明显小于其他组。原因可能是一方面通过调节pH值,使环境呈弱碱性,抑制了损伤部位病原菌的侵染与生长;另一方面显著提高了苯丙烷代谢途径中次生代谢产物的产生,促进次生代谢产物总酚、类黄酮大量积累,除对病原菌的生长具有一定毒性抑制作用外,也能进一步聚合形成封闭层以隔离病原菌。有研究表明,在马铃薯栓化过程中,精氨和亚精胺被胺氧化酶氧化生成H2O2,并促进软木质合成积累,表明栓化过程可能存在多胺代谢途径[22]。复合药剂处理后损伤山药H2O2含量水平大幅提升,除了对致病菌孢子具有抑制作用外,H2O2参与过氧化物酶介导的酚单体与软木脂的芳香结构氧化偶联[23],酚类物质在细胞壁上聚合,大量木质素的沉积使木栓层增厚,而加强细胞壁结构。同时,H2O2的合成有助于平衡防御反应和底物的消耗和诱导果蔬抗病性,防治病害的发生,保证果蔬品质[24]。复合处理能促进损伤组织提前形成愈伤周皮,提高损伤组织对病菌的抗性,实现果蔬伤口快速愈合。
综上,本研究通过1 mmol/L BABA结合NaHCO3 复合处理机械损伤山药,从损伤山药生理变化角度发现,复合药剂处理抑制了山药易感组织表面外源病原菌侵入和发展,同时诱导以苯丙烷代谢途径为主的次生代谢,提高了活性氧代谢水平。通过快速积累大量栓化所需酚类及聚合介质,促进木质素和软木脂合成,修复损伤细胞形成封闭层。强化的栓化组织能显著提高机械损伤山药对病原菌的抗性,降低伤口水分蒸发,从而维持机械损伤山药储藏品质并延长储藏时间。然而BABA结合NaHCO3 复合处理诱导山药抗病性及愈伤的深层机制研究不足,其中涉及的具体途径还需要进一步从分子水平上探究,为化学诱抗剂的大规模应用实践提供更多研究理论基础。
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