流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV)主要通过雌性库蠓(Culicoides)吸血叮咬反刍动物进行传播，并感染引起流行性出血病(epizootic haemorrhagic disease，EHD)[1]。EHD作为一种严重侵害反刍动物的非接触传染病，广泛流行于热带、亚热带等媒介昆虫活跃的地区，可感染牛[2]、鹿[3]、羊驼和部分山羊[4]等反刍动物，对鹿和牛的危害最为严重[2-4]。疫病的暴发给肉牛养殖业造成了严重的经济损失，扰乱了畜产品的正常国际贸易，2008年世界动物卫生组织(OIE)已将该病列为法定报告的跨境动物疫病[5]。
EHDV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，基因组由Seg-1至Seg-10的10个双链RNA节段构成，Seg-2编码的病毒外层衣壳蛋白VP2，是诱导寄主机体产生特异性中和抗体的主要蛋白，决定着EHDV的血清型[6-7]。EHDV的Seg-2/VP2具有高度变异的特性，不同血清型EHDV毒株之间Seg-2核酸序列的相似度在43.8%～70.1%，VP2氨基酸序列相似度在29.4%～72.2% [8]。值得注意的是，同一种血清型的不同地域毒株间Seg-2核酸序列的差异度可达29.5%，据此可将同一种血清型EHDV毒株进一步分为2种地域型，Eastern型与Western型 [9]。澳大利亚、日本和中国的EHDV分离株均属Eastern型，而分离自美洲、非洲、中东的EHDV毒株为Western型[10]。
目前世界范围已发现9种血清型的EHDV(EHDV-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9和-10)。EHDV的不同血清型毒株在世界各地区的流行存在较大差异：北美洲和南美洲主要流行有EHDV-1、-2、-6型[10]；非洲主要流行有EHDV-1、-4、-6、-9型[4]；澳大利亚流行有EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8型[11]；地中海地区流行有EHDV-6与-7型[12]，日本流行有EHDV-1、-2、-7与-10等4种血清型[13]。我国也同样存在多种血清型EHDV的流行，广西流行有EHDV-5、-6、-7、-8血清型[14]，广东流行有EHDV-1与-5型[15]，内蒙古存在EHDV-6型[16]，云南省流行有EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-10型[17]。随着近年来全球一体化进程的深入及全球气候变暖，EHD作为一种虫媒跨境传播疫病，在世界范围的活动范围正日趋扩大，导致的经济损失也在逐步增多。
由于不同血清型EHDV毒株间缺乏交叉免疫保护，在自然界中甚至存在一头动物被多种血清型EHDV感染的现象，给病毒的血清型鉴定和防控工作带来了极大的阻力[18]，因此，快速准确鉴定本地区流行的EHDV毒株血清型具有重要意义。目前，国内尚无EHDV血清型特异性RT-PCR检测方法的报道，因此，根据我国流行的EHDV序列特征，建立快速准确的EHDV血清型诊断方法不仅是控制疫情的必要前提，也是制定动物免疫计划的基础。本研究报道了7种血清型EHDV(EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10)特异性RT-PCR检测方法的建立以及在中国分离EHDV毒株血清型鉴定上的应用，旨在为我国开展EHDV的病原学诊断与流行病学调查提供有力保障。
1 材料与方法
1.1 毒株和质粒
研究中使用的31株分离自中国的EHDV毒株见表1，蓝舌病病毒(bluetongue virus，BTV)，阿卡斑病病毒(akabane virus,AKAV)和中山病病毒(chuzan virus,CHUV)由笔者所在实验室保存。EHDV-2型毒株(AUS1979/01)与EHDV-8型毒株(AUS1982/06)源自澳大利亚麦克阿瑟-伊丽莎白(EMAI)研究所。EHDV Seg-5(基因节段5，编码NS1蛋白)全长克隆质粒PLB-EHDV-Seg5由笔者所在实验室构建保存。
表1 在中国分离的EHDV信息
Table 1 EHDV information isolated from China
病毒编号Number血清型Serotype分离日期Date分离地点Region经度Longitude纬度Latitude动物AnimalV128EHDV-12013/9/17V258EHDV-62016/8/23V260EHDV-62016/8/23V261EHDV-62016/8/23广东汕头Shantou,Guangdong E116°40N23°21′奶牛CowV259EHDV-62016/8/31V262EHDV-62016/8/31V263∗EHDV-62016/8/31V194∗EHDV-12016/6/11广西合浦Hepu,Guangxi E108°55′N21°29′黄牛CattleV195EHDV-12016/6/11V125EHDV-52013/6/27V126EHDV-52013/6/27广西马山Mashan,Guangxi E108°09′N23°42′水牛BuffaloV129EHDV-52013/7/4V127∗EHDV-52015/7/4广西融水Rongshui,Guangxi E109°15′N25°8′水牛BuffaloV023∗★EHDV-52013/9/16V024EHDV-52013/9/16云南德宏Dehong,Yunnan E98°31′N24°23′黄牛CattleV132∗EHDV-12014/7/29V271∗EHDV-52014/6/18V274∗EHDV-62014/7/24云南普洱Puer,Yunnan E101°51′N22°35′黄牛CattleV270∗EHDV-52014/8/13V278∗EHDV-72015/8/19V003∗★EHDV-62012/7/18V277∗EHDV-102013/6/12V269∗★EHDV-72013/8/13V083∗★EHDV-12014/8/12V273∗EHDV-62015/7/14云南师宗Shizong,Yunnan E104°17′N24°36′黄牛CattleV276∗EHDV-62015/8/25V281EHDV-12016/6/8V283EHDV-62016/6/15V282EHDV-102016/7/11V275EHDV-52016/10/18V280∗★EHDV-102017/7/11
注：*表示该毒株已经完成全基因组测序，★表示选择作为不同血清型EHDV的代表毒株进行RT-PCR特异性实验。Note:* represents that the whole genome of the strain has been sequenced,★represents that the strain was selected as a representative strain of different serotypes of EHDV for specific test.
1.2 主要试剂
MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit购自Ambion公司；Premix Ex Taq (Probe qPCR) Kit、One Step RT-PCR Kit、PrimeScriptⅡ逆转录酶、RNAse Inhibiter、dNTP(10 mmol/L)、Radom 6 mers随机引物(50 μmol/L)、EX Taq DNA聚合酶、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、pMD19-T载体、E. coli DH5α感受态细胞和DL5000 Marker购自TaKaRa公司。
1.3 引物设计
从GenBank中下载不同血清型EHDV毒株Seg-2序列，使用MEGA 7.0软件与我们前期获取的15株中国分离EHDV-1、-5、-6、-7、-10型代表毒株(表1)的Seg-2全长序列进行序列比对。根据序列比对结果，选择不同血清型EHDV Seg-2的保守区域使用Primer Premier 6软件进行EHDV血清型特异性RT-PCR引物的设计(表2)。引物由武汉金开瑞生物有限公司合成，纯度为HAP级，用DEPC水溶解、稀释至终浓度为10 μmol/L。
表2 EHDV血清型RT-PCR扩增引物
Table 2 Different EHDV serotype-specific primer of RT-PCR
引物编号Primernumber血清型Serotype地域型Topotype引物名称Primername引物序列(5′-3′)Primer sequence(5′-3′)引物位置Position产物大小/bpAmpliconlengthP1EHDV-1WesternEHDV1-S2-FAACGGACAATCGTGGTGAGAG1 230～1 251EHDV1-S2-RGCATACAGCATAGCAACGGTAG2 378～2 4021 194P2EHDV-2EasternEHDV2-S2-FGGAGATACTATTTATAAATGGGA1 311～1 334EHDV2-S2-RGCCCTATTCACATTCTCATAG2 321～2 3421 052P5EHDV-5EasternEHDV5-S2-FAAGGAGACAACTTCGGAAGAGG1 369～1 390EHDV5-S2-RCCAGCGGAATCAAGTCTTCTAC2 342～2 363996P6EHDV-6EasternEHDV6-S2-FAGTTGCCCAAGAGTATGTGA1 229～1 249EHDV6-S2-RCATCATTCTGTAAAGATAGGTCG2 116～2 139913P7EHDV-7EasternEHDV7-S2-FAAGTGCGGAACATAAGAGATA1 051～1 036EHDV7-S2-RAAGAGTTTGTAGTACCTCATTCC2 180～2 2031 211P8EHDV-8EasternEHDV8-S2-FATATACGAGGAGTGAGTGGTGAG1 035～1 057EHDV8-S2-RTGCCATCAGGATCATTGAGACA2 074～2 0951 061P10EHDV-10EasternEHDV10-S2-FGGAGATACTATTTATAAATGGGA1 311～1 334EHDV10-S2-RGCCCTATTCACATTCTCATAG2 321～2 3421 052
1.4 病毒核酸提取及cDNA合成
使用病毒核酸提取试剂盒，按说明书操作提取EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10代表毒株(表1)、BTV、AKAV、CHUV的病毒核酸。取5 μL提取的核酸为模板进行变性处理，使用PrimeScriptⅡ逆转录酶以20 μL反应体系进行cDNA的合成：5×PrimeScriptⅡ Buffer 4 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL，Radom 6 mers(50 μmol/L)1 μL，PrimeScriptⅡ RTase(200 U/μL)1 μL，变性RNA 5 μL，补水至20 μL。反应条件为：30 ℃ 10 min，45 ℃ 40 min，72 ℃ 10 min。
1.5 PCR反应体系的建立
使用表2中的EHDV血清型RT-PCR引物与对应的不同血清型EHDV代表毒株的cDNA进行PCR扩增，不同血清型反应体系均同时设立阴性对照。PCR反应体系为：cDNA模版1 μL，Ex Taq(5 U/μL)0.125 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加水补充至25 μL。反应条件为：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30个循环；72 ℃ 5 min。取PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，将符合扩增片段大小的PCR产物进行胶回收后，与T载体进行连接转化，筛选阳性菌落进行测序。
1.6 特异性试验
取合成的7种血清型EHDV(EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10)、BTV、AKAV和CHUV的cDNA 1 μL为模板，使用表2中不同血清型引物，按建立的PCR反应体系进行PCR检测，不同血清型EHDV反应体系均同时设立阴性对照，取PCR产物进行电泳检测，分析EHDV血清型RT-PCR引物的特异性。
1.7 敏感性试验
以10倍梯度稀释的PLB-EHDV-Seg5质粒为标准品(拷贝数为：1.5×102～1.5×108 拷贝/μL)建立标准曲线，取1 μL不同血清型EHDV代表毒株cDNA为模板，采用绝对定量qPCR方法计算出不同血清型EHDV的cDNA拷贝数后将其进行10倍梯度稀释。取1 μL稀释后不同梯度的cDNA为模板，使用对应的血清型特异性引物进行PCR反应，不同血清型反应体系均设立阴性对照，确定该方法可检出的最低模板拷贝浓度，分析EHDV血清型RT-PCR引物的检测灵敏度。
1.8 中国分离EHDV毒株血清型的RT-PCR定型
取分离自我国云南省、广西壮族自治区与广东省的31株EHDV毒株病毒液各50 μL(表1)提取病毒核酸。取5 μL变性后的核酸为模板，使用EHDV群特异性引物和血清型特异性引物进行一步法RT-PCR反应，鉴定各毒株的血清型并同前期血清中和试验结果进行对比。将不同血清型阳性PCR产物送上海捷瑞公司进行测序，测序引物为EHDV各血清型RT-PCR引物。
使用DNASTAR软件对测序结果进行拼接，Mafft-win[19]软件进行序列的比对，MEGA 7.0[20]进行系统发生树的构建，建树选择的模型为：Neighbor-joining(邻近法)，P-distance(遗传距离模式)，Bootstrap(自举检验)取值1 000。系统发生树中其他国家分离的EHDV毒株序列以“GenBank序列号_病毒血清型_分离地点_分离时间”表示。
2 结果与分析
2.1 PCR反应体系的建议及产物鉴定
取不同血清型EHDV代表毒株(EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8和-10血清型毒株)cDNA为模板，用对应的血清型特异性引物进行PCR扩增，同时每种血清型均设立阴性对照。结果显示7种血清型EHDV Seg-2的扩增产物大小在800～1 200 bp，每种血清型阴性对照(N1～N10)均未出现非特异性扩增(图1)。对PCR产物进行T-A克隆的测序结果显示，所获得的节段均为EHDV的Seg-2基因片段：EHDV-1型代表毒株与分离自美国的Western毒株相似度最高(>85%)，EHDV-2、-5、-6、-7与-10型代表毒株与分离自澳大利亚和日本的Eastern毒株相似度最高(>95%)，表明设计的不同血清型RT-PCR引物可有效完成对应血清型毒株Seg-2片段的扩增。
1:EHDV-1(YNSZ/V083/2014),2:EHDV-2(AUS1979/01),5:EHDV-5(YNMS/V023/2013). 6:EHDV-6 (YNSZ/V003/2012),7:EHDV-7(YNSZ/V269/2013),8:EHDV-8(AUS1982/06),10:EHDV-10 (YNSZ/V277/2013); N：阴性对照 Negative control； M:DL5000 DNA marker.
图1 不同血清型EHDV PCR检测结果
Fig.1 Detection of different serotypes of EHDV by PCR
2.2 特异性试验结果
以BTV、AKAV、CHUV和7种血清型EHDV(EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8和-10)的cDNA为模板，分别使用表2中不同血清型EHDV鉴定引物(P1～P10)进行PCR扩增，均设立阴性对照，分析引物的特异性。结果显示：EHDV血清型RT-PCR引物仅与对应血清型EHDV毒株的cDNA模板间有特异性的扩增条带产生，条带大小在800～1 000 bp，与其他血清型EHDV毒株，及相关病毒BTV、AKAV和CHUV之间及阴性对照无非特异性扩增产物出现(图2)，表明EHDV血清型RT-PCR引物具有良好的特异性。
1、2、5、6、7、8、10：同图1 The same as Fig.1； B：蓝舌病毒株BTV； A:阿卡斑病病毒AKAV； C：中山病病毒 CHUV； N:阴性对照 Negative control； M：DNA分子质量标准DL5000 DNA marker.
图2 EHDV血清型引物特异性检测
Fig.2 The specificity assay of EHDV serotype primers
2.3 灵敏度试验结果
通过绝对定量qPCR计算出EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10不同血清型EHDV代表毒株的cDNA拷贝数分别为1.1×109、1.4×1010、1.2×1011、3.6×1010、2.4×1010、8.7×108和2.1×109/μL。将上述cDNA进行10倍梯度连续稀释后，以对应的血清型特异性引物(P1～P10)进行PCR反应，分析EHDV血清型RT-PCR引物的灵敏度。结果显示EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10血清型特异性RT-PCR引物对不同血清型EHDV核酸检测的最低拷贝数可达到为102 拷贝(图3)，表明EHDV血清型RT-PCR引物具有良好的灵敏性。
1～10：病毒cDNA 101～1010倍稀释 The viral nucleic acid dilution was 101-1010； N：阴性对照 Negative control； M：DNA分子质量标准 DL5000 marker.
图3 EHDV血清型引物灵敏度检测
Fig.3 Sensitive detection of EHDV serotype primers
2.4 中国分离EHDV毒株的血清型RT-PCR鉴定结果
对分离自我国云南省、广西壮族自治区与广东省的31株EHDV毒株进行群特异性和血清型特异性一步法RT-PCR扩增，结果显示：31株EHDV分属EHDV-1、-5、-6、-7、-10等5种血清型，与前期中和试验鉴定的血清型结果吻合。将扩增的中国EHDV毒株Seg-2进行测序，构建的系统发育树(图4)显示，我国云南省、广东省与广西壮族自治区分离的31株EHDV分属EHDV-1、-5、-6、-7与-10等5种血清型，并以对应的血清型参考毒株聚为一簇，进一步表明血清型RT-PCR扩增的正确性。我国流行的EHDV-1型毒株的Seg-2属Western型，与分离自美国、尼日利亚的EHDV-1型毒株具有共同的起源，而我国流行的EHDV-5、-6、-7、-10型等毒株的Seg-2与分离自日本、澳大利亚的对应血清型毒株聚为一簇，均属Eastern型，有着最近的亲缘关系。
3 讨 论
EHDV的血清型主要由Seg-2编码的VP2决定，因此，Seg-2是EHDV血清型鉴定的首选靶基因。英国Pirbright实验室根据分离自非洲与中东地区的EHDV毒株Seg-2序列，初步建立了EHDV血清型特异性RT-PCR检测方法[21-22]。但是研究中我们发现Pirbright实验室开发的EHDV血清型RT-PCR引物对部分中国EHDV毒株无法扩增，或者扩增产物十分微弱，测序无信号产生。通过EHDV代表毒株的全基因组测序分析我们发现，Pirbright实验室公布的EHDV血清型RT-PCR引物与北美洲和中东的EHDV毒株的Seg-2序列具有较高的匹配度，但与中国不同血清型EHDV的Seg-2序列的匹配度较低，存在较多的碱基错配，这是导致引物对中国EHDV毒株无法扩增或者扩增效果较差的主要原因；此外，在日本和我国均发现EHDV-10型[23]，目前尚无该血清型特异性RT-PCR鉴定方法的报道。因此，针对我国流行的EHDV血清型毒株Seg-2序列特征，设计引物和建立我国流行的EHDV毒株血清型鉴定RT-PCR方法十分必要。
目前血清中和试验是国际上血清检测的金标准，但该方法有操作要求高、检测时间长和必须获得血清型完整的标准毒株或血清等缺点，不利于EHDV血清型的快速鉴定。而病毒核酸的分子检测具有操作简便、检测样本量多、准确和快速等优点，已被广泛应用于各类疾病的快速诊断及血清型鉴定等方面。本研究以我国流行的5种血清型EHDV(EHDV-1、-5、-6、-7和-10)和澳大利亚的EHDV-2、EHDV-8型毒株的Seg-2序列为靶基因，设计血清型特异性RT-PCR检测引物用于EHDV的血清型检测。EHDV-4和EHDV-9型主要流行于非洲，目前世界范围仅报道过1株EHDV-4型毒株(NIG1968/01)在尼日利亚的分离[8]，而EHDV-9毒株序列尚未在GenBank上公布任何序列信息，由于缺乏参考毒株，我们暂无法建立EHDV-4与EHDV-9型血清型RT-PCR的检测方法。
不同血清型EHDV参考毒株以▲表示，本研究中获取的序列以●表示。Reference strains of different serotypes of EHDV are expressed in triangles; virus sequences obtained in this study are represented by dots.
图4 基于NJ法的EHDV 参考毒株和中国毒株Seg-2序列的系统发育分析
Fig.4 Neighbor-joining tree,showing relationships in Seg-2 between reference and field strains of EHDV from China
本研究建立的EHDV血清型RT-PCR方法具有较好的特异性，在不同血清型EHDV间无交叉反应，与同样感染反刍动物的BTV、AKAV和CHUV等病毒之间也无交叉反应，可准确鉴定出EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10等7种不同血清型的EHDV毒株。由于不同EHDV毒株在细胞上的增殖复制能力不同，导致分离EHDV毒株的病毒滴度及增殖特性差异明显，因此要求EHDV血清型RT-PCR方法应具备良好的灵敏度。灵敏度试验结果显示，本研究建立的方法对不同血清型EHDV核酸分子检测的最低下限均为102 拷贝，表明该血清型RT-PCR方法有较高的灵敏度。我国分离的31株EHDV毒株的血清型RT-PCR鉴定结果显示，这31株EHDV毒株分属EHDV-1、-5、-6、-7血清型，与前期病毒血清型鉴定的血清中和试验结果吻合，表明该方法可成功应用于我国流行的EHDV血清型鉴定。
建立EHDV血清型RT-PCR的另一个优势在于可以通过对扩增产物测序，进一步了解病毒Seg-2的遗传特性，从而分析病毒可能的来源以及病毒的活动规律，这将有助于更好地了解病毒的分布与流动情况。本研究中我们通过对中国EHDV毒株的测序发现：流行于我国云南、广东与广西EHDV-1的Seg-2均属于Western型，与美国毒株的亲缘关系最近， EHDV-5、-6、-7与-10型属于Eastern型，在遗传进化上与澳大利亚和日本毒株最接近，表明了我国EHDV起源上的多样性，因此，该EHDV RT-PCR方法具有较好的推广使用价值。下一步我们准备在EHDV血清型RT-PCR的基础上开发EHDV血清型荧光定量RT-PCR方法，进一步提高检测灵敏度和缩短鉴定时间，实现对临床血液样本中EHDV血清型的快速鉴定。
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